Interferon

Cell Death & Disease Band 14, Artikelnummer: 319 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde eine starke Korrelation zwischen der NOS2- und COX2-Tumorexpression und schlechten klinischen Ergebnissen bei ER-Brustkrebs festgestellt. Die Mechanismen der Tumorinduktion dieser Enzyme sind jedoch unklar. Die Analyse des Krebsgenomatlas (TCGA) ergab Korrelationen zwischen der NOS2- und COX2-Expression und den Th1-Zytokinen. Hierin zeigt die Einzelzell-RNAseq-Analyse von TNBC-Zellen eine starke NOS2- und COX2-Induktion durch IFNγ in Kombination mit IL1β oder TNFα. Da IFNγ von zytolytischen Lymphozyten sezerniert wird, was die klinischen Ergebnisse verbessert, stellt diese Rolle von IFNγ eine Dichotomie dar. Um dieses Rätsel zu lösen, wurden Tumor-NOS2-, COX2- und CD8+-T-Zellen in aggressiven ER–-, TNBC- und HER2+-Brusttumoren räumlich analysiert. In Anwesenheit von stromabeschränkten CD8+-T-Zellen kam es an der Tumor/Stroma-Grenzfläche zu einer starken Expression und Clusterbildung von NOS2-exprimierenden Tumorzellen. Eine hohe Expression und Clusterbildung von COX2-exprimierenden Tumorzellen erstreckte sich bis in Immunwüstenregionen im Tumorkern, wo die Penetration von CD8+-T-Zellen begrenzt war oder fehlte. Darüber hinaus befanden sich Tumorzellen mit hoher NOS2-Expression in der Nähe von Bereichen mit erhöhter Satellitose, was auf Zellcluster mit einem höheren Metastasierungspotenzial schließen lässt. Weitere In-vitro-Experimente ergaben, dass IFNγ + IL1β/TNFα die Verlängerung und Migration behandelter Tumorzellen steigerte. Diese räumliche Analyse der Tumormikroumgebung liefert wichtige Einblicke in bestimmte Nachbarschaften, in denen stromabeschränkte CD8+-T-Zellen in der Nähe von NOS2-exprimierenden Tumornischen existieren, die ein erhöhtes Metastasierungspotenzial haben könnten.

Östrogenrezeptor-alpha-negativer (ER−) und dreifach negativer Brustkrebs (TNBC) machen einen geringeren Anteil der Brustkrebsarten aus, gehören aber im Vergleich zu weniger aggressiven ER+-Tumoren zu den aggressivsten bösartigen Erkrankungen mit begrenzten Behandlungsstrategien [1]. Im letzten Jahrzehnt zeigte ein erheblicher Anteil der Krebsarten eine erhöhte NOS2-Expression [2], wobei Krebsarten vom Melanom bis zum Gliom NOS2 überexprimieren [3,4,5,6]. Bei Brustkrebs wurde bei >70 % der Patientinnen ein erhöhter NOS2-Wert berichtet [7]. Interessanterweise korrelierte eine erhöhte Tumor-NOS2-Expression mit der P53-Mutation und war ein Hinweis auf ein schlechtes Überleben bei ER−- (Hazard Ratio = 6), aber nicht bei ER+-Brustkrebspatientinnen [7, 8]. Während eine erhöhte COX2-Expression im Tumor auch ein schlechtes Ergebnis im Sinne einer HR von 2,45 bei ER-Patienten derselben Kohorte vorhersagte [9], war eine erhöhte NOS2/COX2-Koexpression ein starker Hinweis auf ein schlechtes Ergebnis (HR 21) [10]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine erhöhte Tumor-NOS2/COX2-Koexpression das Fortschreiten aggressiver Brustkrebs-Phänotypen vorantreibt [10, 11]; Allerdings bleiben die Mechanismen der NOS2/COX2-Induktion innerhalb von Tumoren unklar.

Die Untersuchung des Krebsgenomatlas (TCGA) hat Korrelationen zwischen der Tumor-NOS2/COX2-Expression und Interferon-Gamma (IFNγ), Interleukin-17 (IL17), IL1 und Toll-like-Rezeptor-4 (TLR4) ergeben, die häufig assoziiert sind mit krebshemmender Wirkung [12]. Interessanterweise sind diese Zusammenhänge widersprüchlich, da eine erhöhte NOS2/COX2-Expression im Tumor schlechte klinische Ergebnisse vorhersagt [7, 9, 10]. Kürzlich wurde bei der Behandlung mit IFNγ und Zytokinen oder TLR4-Agonisten eine erhöhte NOS2- und COX2-Expression in bestimmten Immun- und Tumorzellen entdeckt, was mit der bereits berichteten Feedforward-NOS2/COX2-Signalübertragung übereinstimmt [10, 13]. Diese Ergebnisse deuten auf eine orthogonale Beziehung zwischen der Tumor-NOS2/COX2-Expression hin, die unterschiedliche Tumor-Mikroumgebungen fördern könnte, die zu schlechten klinischen Ergebnissen beitragen [13].

Um diese Möglichkeiten zu erkunden, zeigen wir hier, dass Th1-Zytokine die NOS2- und COX2-Expression in Tumorzellen in vitro wirksam stimulieren. Die Einzelzell-RNAseq-Analyse (scRNAseq) ergab, dass IFNγ in Kombination mit Interleukin 1β (IL1β) oder Tumornekrosefaktor Alpha (TNFα) eine höhere NOS2/COX2-Expression induzierte als die Zytokine als Einzelwirkstoffe. Darüber hinaus wurden durch diese Behandlungen Zytokine induziert, die in ER-Brusttumoren mit hoher NOS2-Expression hochreguliert waren [7, 10], einschließlich IL6 und IL8, und mit der NOS2/COX2-Expression korreliert. Außerdem zeigt diese Studie eine einzigartige Synergie zwischen IL1α/β, die die Expression von NOS2 und COX2 verstärkt. Die räumliche Multiplex-Bildgebung zeigte Cluster von Zellen mit hoher NOS2-Expression in der Nähe von Bereichen stromabeschränkter CD8+-T-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie IFNγ produzieren, und deutet auf eine kleine entzündliche Nische an der Tumor/Stroma-Grenzfläche in diesen Tumoren hin. Während COX2 in diesen Regionen vorhanden war, wurde es weiter im Tumor hinein stärker exprimiert, in Immunwüstengebieten mit geringer Penetration von CD8+-T-Zellen. Der Vergleich unterschiedlicher Stellen innerhalb desselben Tumors oder geografischer Regionen zwischen Tumoren lässt auf ein räumliches und zeitliches Fortschreiten der Entzündungsherde in Bereichen mit eingeschränkten Lymphzellen schließen, die sich in Bereichen mit hoher COX2-Expression zu einer Immunwüste entwickeln. Diese neuartigen Beobachtungen liefern eindeutige räumliche Fingerabdrücke aggressiver Tumorphänotypen, die mit einem verringerten krankheitsspezifischen Überleben bei Brustkrebs korrelieren [7, 10].

Unsere früheren Arbeiten zum Vergleich hoher und niedriger NOS2- und COX2-Tumorexpression (auch bekannt als PTGS2) ergaben Zusammenhänge mit einer Vielzahl von Entzündungsmarkern, die typischerweise mit der Antitumoraktivität assoziiert sind [10], was uns dazu veranlasste, die regulatorischen Effekte von Zytokinen auf die NOS2/COX2-Expression zu untersuchen in Tumorzellen und -geweben. Mithilfe des Xena-Browsers und der TCGA-Datenbank wurde eine Korrelationsanalyse durchgeführt, um ein tieferes Verständnis der mit der NOS2- und COX2-Expression bei ER-Brustkrebs verbundenen Zustände zu gewinnen. Die Korrelationsanalyse von TCGA-BRCA (Brustkrebs) ergab mehrere Entzündungswege, die mit einer erhöhten Tumor-NOS2/COX2-Expression verbunden sind (Abb. 1A), die die klinischen Ergebnisse beeinflussten (Abb. 1B), einschließlich der Antitumor-assoziierten IFNγ, TNFα, IL2, IL1 und IL17-Signalwege (Abb. 1A). Darüber hinaus waren die Tumor-NOS2/COX2-Expressionen positiv korreliert und Th1-Zytokine hatten die stärkste positive Assoziation mit COX2, wohingegen IL1β mit NOS2 assoziiert war (Abb. 1A). Diese Ergebnisse deuten auf eine Dichotomie innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) hin, wo Zytokine, die im Allgemeinen mit günstigen Ergebnissen verbunden sind, auch erhöhte Tumor-NOS2/COX2-Expressionen fördern (Abb. 1A), die starke Prädiktoren für ein schlechtes krankheitsspezifisches Überleben in der ER-Brust sind Krebspatienten (Abb. 1B) [7, 9, 10]. Um die regulatorische Rolle dieser Zytokine bei der Induktion der NOS2- und/oder COX2-Expression zu bestätigen, wurden MDA-MB231 (MB231)-Brustkrebszellen mit IFNγ in Gegenwart und Abwesenheit von TNFα, IL1β, IL17 und TLR4 stimuliert Agonist Lipopolysaccharid (LPS). Einzelzell-RNAseq-Daten zeigten, dass eine 48-stündige Exposition gegenüber IFNγ in Kombination mit TNFα oder IL1β die höchsten Expressionen von NOS2 und COX2 induzierte (Abb. 1C). In Übereinstimmung mit früheren Berichten bei murinen Tumoren [12] erfordert eine hohe NOS2-Expression IFNγ und TNFα/IL1, die einen auffälligen Unterschied in den Zytokinen aufweisen, die während der Induktion muriner Makrophagen und Tumorzellen produziert werden [12]. Darüber hinaus zeigte scRNAseq von Zytokin-stimulierten MB231-Zellen, dass eine 48-stündige Stimulation mit IFNγ in Gegenwart von IL1β oder TNFα die höchsten NOS2- und COX2-Expressionen induzierte, die sich in denselben Regionen des t-SNE-Diagramms sammelten (Abb. 1C, D ). Diese Ergebnisse bestätigen, dass eine hohe NOS2- und COX2-Expression durch IFNγ in Kombination mit IL1β oder TNFα induziert wird, wie in der TCGA-Analyse gezeigt. Wie vorhergesagt, zeigte die scRNAseq-Analyse von IFNγ + IL1β/TNFα einen Anstieg der Transkriptmengen von NOS2 und COX2 in behandelten MB231-Zellen. Die Anzahl der NOS2-Transkripte lag zwischen 1 und 3, wohingegen die COX2-Transkripte einen deutlich größeren Bereich aufwiesen (Abb. 1D). Während weniger als 9 % der Zellen NOS2-Transkripte enthielten, enthielten bis zu 40 % der Zellen COX2-Transkripte (Abb. 1D). Die NOS2-Expression erforderte IFNγ, wohingegen die COX2-Expression nur schwach durch IL1β oder TNFα allein induziert wurde (Abb. 1D). Nichtsdestotrotz erfolgte, ähnlich wie bei NOS2, die stärkste COX2-Expression durch IFNγ + IL1β/TNFα. Zusätzlich zur Zytokinstimulation könnte die NOS2/COX2-Feedforward-Signalisierung auch eine erhöhte NOS2/COX2-Expression fördern (Abb. 1A), wie bereits berichtet [10].

AA-Heatmap-Anzeige von Pearsons Korrelationsanalyse der TCGA-BRCA-Datenbank (n = 1248) über den UCSC-Xena-Browser zur Analyse von Th1-, Th2-, Th17- und zwei GOI-Genen (Gen von Interesse). Die Heatmap wurde in corrplot (0.92) in R (4.2.1) generiert. B Überlebensanalyse im Zusammenhang mit der Tumorproteinexpression NOS2lo/COX2hi (blauer Pfeil), NOS2lo/COX2lo (grüner Pfeil), NOS2hi/COX2lo (gelber Pfeil) und NOS2hi/COX2hi (roter Pfeil). C t-SNE-Diagramm (Loupe Browser 6.3.0) der Einzelzellanalyse von MB231-Zellen, die mit einzelnen oder einer Kombination der Zytokine IFNγ (100 U/ml), IL1β (10 ng/ml), TNFα (10 ng/ml) behandelt wurden. , IL17 (100 ng/ml) und LPS (10 ng/ml) für 24 und 48 Stunden. Hell- und dunkelgrüne Farbcluster stellen 24- bzw. 48-Stunden-Zeitpunkte dar, die mit der Behandlung mit IFNγ + IL1β/TNFα verbunden sind. Der orangefarbene Kreis zeigt die höchste überlappende Zellclusterung für IFNγ + IL1β oder TNFα nach 48-stündiger Behandlung an. D t-SNE-Diagramme von NOS2- und COX2-Clusterzellen. Gestapelte Balkendiagramme zeigen die Anzahl der NOS2- und COX2-Transkripte pro Zelle in 48-Stunden-Behandlungsgruppen. Transkript-pro-Zellen-Daten (Farbcode: Blau, 1; Orange, 2; Grau, 3; Gelb, 4; Cyan, 5; Grün, 6) wurden mit den R-Paketen (data.table 1.14.2, dplyr 1.0.10) extrahiert und ggplot2 3.3.6).

In Zellpopulationen mit erhöhten CD44- und verringerten CD24-Expressionsniveaus wurde über Krebsstammmarker berichtet, die bei Injektion in Mäusen in sehr geringen Konzentrationen die gleichen arzneimittelresistenten histopathologischen Merkmale des abgeleiteten Tumors aufwiesen [14]. Hierin ergab die t-SNE-Plot-Analyse der CD44/CD24-Expression deutliche Clustermuster (Abb. 2A), die durch erhöhte CD44- und verringerte CD24-Spiegel in Clustern mit hoher NOS2/COX2-Expression nach 48-stündiger Behandlung mit IFNγ + IL1β oder TNFα definiert sind. Dieses Muster deutet auf eine erhöhte Krebsstammzahl hin [14] und steht im Einklang mit früheren Berichten über erhöhte CD44-Spiegel in ER-Brusttumoren mit hoher NOS2-Expression [7, 15]. Die Expression des Gewebeinhibitors Metalloproteinase-1 (TIMP1), einem Fibrosemarker [16], war ähnlich wie bei CD44, was darauf hindeutet, dass ihre Expression wahrscheinlich von demselben vorgeschalteten Regulator gesteuert wurde (Abb. 2A). Um die Expressionsbeziehungen zwischen Th1-Zytokinen zu untersuchen, analysierten wir die Clustermuster von IL6, IL8, IL1α und IL1β (Abb. 2B). Die Clustermuster dieser Zytokine sind sehr ähnlich und überlappen sich nach 48-stündiger Stimulation mit IFNγ + IL1β/TNFα stark (Abb. 2B). Darüber hinaus ergab die Untersuchung anderer Zytokin-induzierter Gene eine starke Assoziation mit IL1α/β (Abb. 2C) und steht im Einklang mit Beobachtungen, die zeigen, dass zirkulierendes IL1β ein schlechtes Überleben vorhersagt [17]. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die in Abb. 1A dargestellte TCGA-BRCA-Korrelationsanalyse.

A t-SNE-Diagramme von Krebsstammzell- (CD24/CD44) und Fibrose- (TIMP1) Markern und B Th1-Zytokin-Markern (IL6, IL8, IL1β, IL1α), die sich in den gleichen Regionen wie NOS2/COX2 in Panel A gruppierten. C Korrelationsanalyse ausgewählter Zytokine, Krebsstammzellmarker und Metastasen-assoziierter Gene. Die Daten wurden aus 48-Stunden-Kontroll-, IFNγ-, IL1β- und IFNγ + IL1β-behandelten Gruppen im Corrplot (0,92) in R (4.2.1) extrahiert. NOS2 wurde in Kontroll- und IL1β-behandelten Zellen nicht exprimiert und ist daher in der Korrelationsanalyse nicht vertreten.

Die oben genannten In-vitro-Ergebnisse zeigen, dass IFNγ ein Schlüsselregulator bei der Induktion der NOS2/COX2-Expression in ER-Brusttumorzellen ist, was die Frage nach dem Ursprung der IFNγ-Sekretion in Tumorgeweben aufwirft. Zytotoxische Lymphozyten setzen IFNγ frei und sind mit einem verbesserten Überleben bei TNBC und anderen Krebsarten verbunden [18,19,20]. Im Gegensatz dazu fördert eine erhöhte NOS2/COX2-Expression im Tumor das Fortschreiten der Erkrankung und ist ein starker Hinweis auf ein schlechtes krankheitsspezifisches Brustkrebsüberleben [7, 9, 10]. Diese Ergebnisse deuten auf eine Dichotomie hin, bei der Antitumor-Lymphoid-produzierende IFNγ-Zellen pro-Tumor-NOS2/COX2-exprimierende Zellnischen induzieren könnten, was möglicherweise auf die Heterogenität innerhalb des TME zurückzuführen ist. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde die räumliche Nähe und Beziehung zwischen CD8+ T-Zellen, die IFNγ produzieren, und Tumor-NOS2/COX2-exprimierenden Zellen in 21 ER-Brusttumoren (einschließlich TNBC (n = 14) und HER2/neu+ (n = 7) untersucht ) Phänotypen) mithilfe räumlicher Multiplex-Bildgebung. Die Fluoreszenzbildgebung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung zellulärer Nachbarschaften auf Einzelzellebene. In bestimmten Regionen des TME wurden Zellen mit hoher NOS2- und COX2-Expression beobachtet, wie in Abb. 3A dargestellt. Räumliche Verteilungs- und Dichte-Heatmap-Analysen des gesamten Tumors zeigen unterschiedliche Regionen von NOS2-, COX2- und CD8+-T-Zellen, in denen NOS2- und COX2-exprimierende Zellen (Abb. 3B, C) in getrennten Nachbarschaften beobachtet wurden. Darüber hinaus wurden höhere CD8+-T-Zelldichten in der Nähe von NOS2-exprimierenden Zellen beobachtet, während niedrigere Dichten in der Nähe von COX2-exprimierenden Clustern identifiziert wurden (Abb. 3B, C). Daher legen räumlich unterschiedliche NOS2- und COX2-exprimierende Zellen im Verhältnis zu CD8+-T-Zellen in aggressiven Brusttumoren einen Zusammenhang zwischen CD8+-T-Zellen und Zytokin-induzierten NOS2/COX2-Nischen nahe, der die klinischen Ergebnisse beeinflusst.

Eine Multiplex-Fluoreszenz eines ER-/HER2+-Brusttumors mit NOS2 (rot), COX2 (grün), CKSOX10 (blau), CD8+ T-Zellen (magenta) und DAPI (weiß). B Räumliche Verteilung (links) und Dichtewärmekarten (rechts) von NOS2-, COX2- oder CD8+-T-Zellen. Die räumlichen Verteilungen spiegeln eine positive Erkennung der Marker innerhalb von Bereichen mit einem Durchmesser von 25 µm wider, unabhängig von der Menge. Dichte-Heatmaps bieten eine visuelle Quantifizierung, die durch die Farbabstufung (niedrig-hoch) Blau, Grün, Gelb, Orange und Rot der Biomarker-Proteinexpressionen widergespiegelt wird. C-Vergleich der räumlichen Verteilungskombinationen NOS2/CD8, COX2/CD8 und NOS2/COX2.

Die NOS2/COX2-Expression in ER-Tumoren, die zuvor durch Routine-Immunhistochemie (IHC) als NOS2/COX2 hoch (hoch) oder niedrig (lo) eingestuft wurden, mit einem Grad von 1–4 [7, 9], wurde auf die NOS2/COX2-Fluoreszenzintensität am analysiert Einzelzellebene mithilfe von Multiplex-Fluoreszenzbildgebung, die räumliche Informationen auf Einzelzellebene in Regionen wie Nekrose, Stroma und lebensfähigem Tumor liefert. Lebensfähige Tumor- und Stromaregionen wurden von einem Veterinärpathologen auf H&E-Bildern (QuPath) [21] kommentiert und mithilfe der HALO-Software mit der NOS2/COX2-Fluoreszenzexpression fusioniert (Abb. 4A). Die NOS2- und COX2-Fluoreszenzintensitäten wurden für jeden Tumor mithilfe der Echtzeitoptimierung in der HALO-Software bestimmt und anschließend wurden die mittleren Intensitäten und Standardabweichungen (SD) bestimmt. Schwellenintensitäten für schwache, mäßige und starke Expressionsniveaus wurden durch Addition von 2, 4 bzw. 6 SD zur mittleren Intensitätsschwelleneinstellung bestimmt. Die anhand dieser Schwellenwerte quantifizierten NOS2/COX2-Fluoreszenzintensitäten des gesamten Tumors (ergänzende Abbildung 1A) stimmten mit den ursprünglich vom IHC-Pathologen bewerteten NOS2/COX2-Expressionsniveaus überein, die zuvor berichtet wurden [7, 9]. Bei der Stratifizierung nach Tumor vs. Stroma war die NOS2/COX2-Tumorexpression mit starker/mäßiger Signalintensität in NOS2/COX2-stark exprimierenden Tumoren signifikant erhöht (ergänzende Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu waren die schwachen NOS2-Signalintensitäten im Stroma, aber nicht im Tumor signifikant erhöht, während die schwache COX2-Signalintensität im Tumor, aber nicht im Stroma höher war (ergänzende Abbildung 1B). Es wurde gezeigt, dass die NOS2- und COX2-Feedforward-Signalisierung [10] ihre Ausdrücke aufrechterhält. Eine mögliche lineare Beziehung zwischen Tumor-NOS2 und COX2 in diesen Tumoren wurde mithilfe des Pearson-Korrelationskoeffizienten untersucht, der lineare Korrelationen zwischen der NOS2- und COX2-Expression bei starker, mäßiger und schwacher Intensität ergab (ergänzende Abbildung 1C). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die NOS2/COX2-Feedforward-Signalisierung, wie in Abb. 1A gezeigt und wie bereits berichtet [10].

Ein H&E-gefärbter Abschnitt (links), verschmolzen mit einem seriellen Fluoreszenzbild (rechts). H&E-Schnitte wurden von einem Pathologen ausgewertet, der Bereiche mit Nekrose (lila), lebensfähigem Tumor (grün) und Stroma (orange) definierte. Dargestellt sind die %NOS2/COX2-exprimierenden Zellen im gesamten Tumor sowie im Tumor und Stroma. B Bereiche in der räumlichen Verteilung, die durch blaue Kästchen mit den Bezeichnungen 1 (oben), 2 (Mitte) und 3 (unten) hervorgehoben sind, spiegeln eine Progression von (1) entzündeten Regionen stromabeschränkter CD8+-T-Zellen zu (2) kalten Regionen mit reduzierten CD8+-T-Zellen wider Stroma-eingeschränkte CD8+-T-Zellen und (3) Kernregionen von kalten Immunwüstentumoren, denen CD8+-T-Zellen fehlen. Räumliche Analysen der NOS2/COX2-Expression in diesen umrahmten Bereichen sowie von CD8+ T-Zellen oder IFNγ werden bei 50 μm Vergrößerung gezeigt. Registrierte Bilder in der entzündeten Region, die in Feld 1 angegeben ist, zeigen C-Stroma-eingeschränkte CD8+-T-Zellen (Cyan) oder D-IFNγ-Expression (Cyan) in der Nähe von NOS2-exprimierenden Zellen (rot). Analysen der in Kasten 2 bezeichneten kalten Regionen zeigen eine hohe COX2-Expression und eine niedrige NOS2-Expression mit E-limitierten CD8+-T-Zellen und F-limitierten IFNγ. Analysen der Kernregionen von Immunwüstentumoren, die mit Kasten 3 assoziiert sind, zeigen eine hohe COX2-Expression des Tumors mit verringerten Spiegeln von G CD8 + T-Zellen und einer verringerten IFNγ-Expression durch H.

Abbildung 4A zeigt einen signifikanten Anstieg der %-Zellen mit erhöhter Tumor-NOS2/COX2-Expression im gesamten Tumor sowie in Tumor- und Stromaregionen. Eine weitere Untersuchung der räumlichen Verteilungen von NOS2 und COX2 ergab, dass NOS2+-Zellen an Tumorrändern oder im Stroma gehäuft sind (Abb. 4B – D). Während in einigen Regionen eine COX2-Expression in der Nähe von NOS2-exprimierenden Zellen beobachtet wurde, waren COX2+-Zellen in bestimmten Bereichen tiefer im Tumorkern sowie in Immunwüstenregionen des Tumors dicht geclustert (Abb. 4E – H). Als NOS2lo/COX2lo bewertete Tumoren zeigten sporadisch NOS2- und COX2-Herde niedriger Dichte, während nur wenige oder keine Herde höherer Intensität beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wiesen NOS2hi/COX2hi-Tumoren zahlreiche, räumlich unterschiedliche, stark exprimierende NOS2- und COX2-Herde mit NOS2-Clustern an der Tumor-Stroma-Grenzfläche auf (Abb. 4C, D). Im Gegensatz dazu zeigen die Kästen 2–3 COX2-Cluster, die tiefer in den Tumorkern hineinragen (Abb. 4E–H). Somit sind NOS2- und COX2-exprimierende Zellen räumlich in bestimmten Entzündungsregionen des Tumors lokalisiert.

Wie in den Abb. dargestellt. 1D und 2C, IFNγ ist für eine optimale NOS2/COX2-Expression in MB231-Zytokin-behandelten Zellen notwendig. Lymphoide Zellen, einschließlich CD8+ T-Zellen, sind eine Quelle der IFNγ-Sekretion [20]. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die räumliche Ausrichtung von CD8+ T-Zellen eine Schlüsselrolle für ein verbessertes Überleben bei TNBC spielt [22]. Das Eindringen von CD8+ T-Zellen in den Tumorkern definierte einen vollständig entzündeten Tumor, der ein besseres Überleben des TNBC-Patienten vorhersagte [22]. Im Gegensatz dazu waren eine begrenzte Penetration von CD8+-T-Zellen in den Tumorkern (≤ 100 CD8+-T-Zellen/mm2) oder stroma-beschränkte CD8+-T-Zellen mit fibrotischen oder immunsuppressiven Tumorimmunmikroumgebungen verbunden, was ein schlechtes Überleben vorhersagte [22]. Daher ist die räumliche Lokalisierung von CD8+-T-Zellen ein Prädiktor für die klinischen Ergebnisse [22]. Ergänzende Abbildung 2 beschreibt die Klassifizierung der starken Einzelzellintensität von NOS2/COX2 im Verhältnis zum Vorhandensein von CD8+ T-Zellen in allen Tumoren. Angesichts der Vorhersagekraft der räumlichen Lokalisierung von CD8+-T-Zellen [22] beobachteten wir reichlich stroma-beschränkte CD8+-T-Zellen (Abb. 4C) mit erhöhter IFNγ-Expression (Abb. 4D) in Regionen in der Nähe einer erhöhten Tumor-NOS2-Expression, was auf einen möglichen Zusammenhang hinweist zwischen CD8+ T-Zellen, IFNγ und NOS2-Regulation (Abb. 4C, D). Im Gegensatz dazu zeigen Abb. 4E–H Bereiche mit begrenzten CD8+-T-Zellen sowie begrenzter IFNγ- und NOS2-Expression. Wichtig ist, dass COX2 in diesen Regionen stark exprimiert wird (Abb. 4E – H). Die Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden ebenfalls bestimmt und zeigten eine signifikante Korrelation zwischen Tumor-NOS2hi-exprimierenden Zellen und CD8+-T-Zellen/INFγ (ergänzende Abbildung 3A). Interessanterweise wurde keine signifikante Linearität zwischen CD8+ T-Zellen/IFNγ und der Tumor-COX2-Expression beobachtet (ergänzende Abbildung 3B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CD8+ T-Zellen eine Quelle für IFNγ darstellen könnten, was zu einer erhöhten Tumor-NOS2-Expression führt.

Die Stimulierung onkogener Signalwege durch NO ist durch einen verstärkten Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT), Migration und Beweglichkeit von Krebszellen gekennzeichnet, was zum Fortschreiten der Krebserkrankung und zur Metastasierung führt [23, 24]. Patienten in dieser Kohorte erlagen einer metastatischen Erkrankung, obwohl zum Zeitpunkt der Diagnose kein Lymphknoten-positiver Status beobachtet wurde. NOS2hi-Regionen befanden sich in der Nähe von stromabeschränkten CD8+-T-Zellen. NOS2hi-Bereiche wiesen kleine Tumorcluster auf, die sich scheinbar von der primären Läsion lösten (Satellitose), was auf metastatische Nischen hinweist (Abb. 5A, Kasten 1, 5B und 5C). Im Gegensatz dazu fehlte Satellitose in Regionen mit geringerer Tumor-NOS2-Expression sowie weniger CD8+-T-Zellen und IFNγ (Abb. 5D, E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NOS2hi-Clusterherde ein erhöhtes Metastasierungspotenzial fördern könnten, was mit früheren Berichten übereinstimmt [15, 25].

A Räumliche Verteilung des gesamten Tumors mit blauen Kästchen mit den Bezeichnungen 1 (oben), 2 (Mitte) und 3 (unten), die eine B-, C-Vergrößerung der räumlichen Lokalisierung von NOS2 (rot) und den Tumormarker CKSOX10 (blau) exprimierenden Zellen zeigen in einer NOS2hi-Region (50 μm), die in Kasten 1 hervorgehoben ist. Dargestellt sind sowohl längliche als auch gruppierte NOS2-exprimierende Zellen, die sich von der größeren Läsion gelöst haben, was auf Satellitose und ein erhöhtes Metastasierungspotential hinweist. Diese Phänotypen werden in kalten Immunregionen (D) oder Immunwüstenregionen (E) nicht beobachtet.

Die Zellmorphologie ist ein Schlüsselaspekt der Metastasierung, bei der Zellen während Migrations- und Invasionsprozessen einen verlängerten Phänotyp annehmen. In-vitro-Migrationsmodelle haben gezeigt, dass NO bei metastatischen Prozessen eine Rolle spielt, wobei die Exposition gegenüber einem höheren NO-Fluss (100–300 nM) für 24–48 Stunden die In-vitro-Migration und Invasion von MB231- und MB468-Brustkrebszellen erhöhte [7, 15]. Diese früheren Beobachtungen legen nahe, dass eine erhöhte NOS2-Expression und Clusterbildung im Tumor einen NO-Fluss erzeugen würde, der das Metastasierungspotenzial exponierter Zellen in dieser Nische erhöht [15]. Hierin untersuchten wir weiter den Einfluss der NOS2/COX2-Expression von Tumorzellen auf die veränderte Zellmorphologie. Wie in Abb. 6A, B gezeigt, zeigten MB231-Zellen, die einer individuellen oder kombinierten Zytokinbehandlung ausgesetzt waren, morphologische Veränderungen und Zellverlängerungen, die für EMT in migrierenden und eindringenden Zellen charakteristisch sind. Darüber hinaus zeigte der Scratch-Test-Assay im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen einen erhöhten Wundverschluss nach 12 Stunden IFNγ + TNFα-Kombinationsbehandlung (Abb. 6C). In ähnlicher Weise zeigten Boyden-Kammer-Assays eine erhöhte Zellinvasion als Reaktion auf eine 48-stündige Kombinationsbehandlung mit IFNγ + TNFα, die durch die Pan-NOS/COX-Inhibitoren (LNAME/Indomethacin) sowohl als einzelne Behandlungsmittel als auch in Kombination reduziert wurde (Abb. 6D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Hochregulierung der NOS2/COX2-Tumorexpression innerhalb einer entzündlichen Nische Phänotypen mit erhöhtem Metastasierungspotential erzeugen könnte (Abb. 6).

A Mikroskopbilder (10fach) von Kontroll- und Zytokin-behandelten MB231-Zellen für 48 Stunden. B-Zellverlängerungsanalyse nach 48-stündiger Zytokinbehandlung. CA-Scratch-Test-Assay von MB231-Zellen nach 12 Stunden Zytokinbehandlung. D-Zellinvasionsassay; MB231-Zellen wurden 48 Stunden lang in der oberen Vertiefung einer Boyden-Kammer mit serumfreien Medien ± Zytokinen und den Pan-NOS/COX-Inhibitoren LNAME und Indomethacin ausgesät. Die untere Kammer wurde mit vollständigem Medium gefüllt. Die Zellen wurden anhand der Standardkurve gezählt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001.

Einer der wirksamsten prognostischen Indikatoren für ER-Brustkrebs ist der Zusammenhang zwischen NOS2 und COX2 [10, 26]. Die obigen Daten zeigen einen ungewöhnlichen Zusammenhang zwischen IFNγ und lymphoiden Zellen im Hinblick auf die klinischen Ergebnisse, wie in Abb. 7 zusammengefasst. IFNγ und CD8+ T-Zellen sind mit der Produktion hoher NOS2- und COX2-Spiegel verbunden und für die Produktion notwendig, obwohl sie sind ein Hinweis auf positive klinische Ergebnisse und ein Kennzeichen einer guten Prognose bei vielen bösartigen Erkrankungen [22, 27]. Den scRNAseq-Ergebnissen zufolge sind IFNγ und IL1β/TNFα notwendig, um die höchsten NOS2- und COX2-Expressionsniveaus zu induzieren, was darauf hindeutet, dass Lymphzellen ein Faktor sein könnten, der zum Tumor beiträgt. Früheren Untersuchungen zufolge ist IFNγ entscheidend für die Stimulation von NOS2 in DLD1-Zellen (menschlicher Dickdarmkrebs) [28]. Außerdem zeigt die scRNAseq von MB231 mit IFNγ + IL1β eine starke Verbindung zwischen NOS2/COX2 und IL1β, TNFα, IL6 und IL8, was die Vorstellung einer verstärkten Th1-Mikroumgebung, die aus dem TCGA gewonnen wurde, untermauert (Abb. 1). Dies impliziert multifaktorielle Immunmechanismen, die zu einer Feedforward-Schleife führen, die die Induktion von zellulären Nischen mit hoher NOS2/COX2-Expression und das Fortschreiten der Krankheit fördert. Frühere Studien haben gezeigt, dass IFNγ, IL6, PGE2 und IL1 alle die NOS2-Expression steigerten, was darauf hindeutet, dass mehrere verstärkende Prozesse an der NOS2-Hochregulierung beteiligt waren [15]. Darüber hinaus ist IL1α ein Mediator von ER-Stress, der häufig bei TME nach Chemotherapie beobachtet wird. Sowohl IL1α als auch ILβ nahmen als Reaktion auf IFNγ zu, und IL1β verstärkt diese komplementären Wege für die nachhaltige Erhöhung der NOS2/COX2-Mechanismen erheblich. Diese Faktoren könnten zusammenwirken und eine NOS2/COX2-Entzündungsnische schaffen, die das Fortschreiten der Krankheit fördert.

Die Sekretion von IFNγ durch stromabeschränkte CD8+-T-Zellen und IL1β/TNFα, die von myeloischen Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung sezerniert wird, führt zur Tumor-NOS2/COX2-Expression und der Entwicklung aggressiver Zellnischen mit erhöhtem Metastasierungspotenzial und fördert die Immunsuppression. Zellumgebungen, die eine hohe Tumor-NOS2/COX2-Expression aufweisen, erhöhen dann IL1α/β, wodurch eine Feedforward-Schleife entsteht, die die Tumor-NOS2/COX2-Expression und erhöhte Zytokine, einschließlich IL8 und IL-6, sowie die Aktivierung von latentem TGFβ durch NO aufrechterhält. Diese Faktoren wirken zusammen, um Immunsuppression, Metastasierung und Krebsstammbildung durch NOS2-abgeleitetes NO und COX2-abgeleitetes PGE2 zu fördern.

Obwohl die Sequenz und Biochemie des Proteins bei Maus und Mensch vergleichbar sind, ist der NOS2-Promotor kompliziert und unterscheidet sich erheblich zwischen den beiden Arten [28,29,30]. Die Expression von NOS2 in murinen Makrophagen, die in vitro maximal durch IFNγ oder LPS induziert wurde, war der Goldstandard im NO-Bereich, wo der geschätzte NO-Fluss auf zellulärer Ebene bis zu 1–5 µM erreichen könnte [13]. Maustumorzellen zeigten eine signifikant höhere NOS2-Aktivität als Reaktion auf IFNγ oder LPS, was auf einen wesentlichen Unterschied zwischen Tumorzellen und Makrophagen schließen lässt [13]. Während die hier vorliegenden Daten deutlich zeigen, dass die maximale menschliche NOS2-Expression durch IFNγ, IL1β und TNFα induziert wird, identisch mit der in murinen Tumorzellen, aktivieren menschliche Makrophagen NOS2 nicht mit IFNγ oder LPS. Allerdings unterscheiden sich die von Maus- und menschlichen Tumorzellen produzierten NO-Werte auf grundsätzlicher Ebene immer noch erheblich. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Anzahl der NOS2+-Zellen und nicht die NOS2-Expression mit der in vitro produzierten Menge an NO und Nitrit korreliert [11]. Infolgedessen beeinflussen die Cluster von NOS2-exprimierenden Zellen den NO-Spiegel, und die Clusterbildung von NOS2-Zellen kann Bereiche mit einem größeren NO-Fluss erzeugen [13, 31]. In-vitro-Experimente zeigen, dass hohe Nitrit- und NO-Werte vorliegen, wenn 50–80 % der Zellen NOS2 exprimieren und die Flüsse höher als 100 nM sind. Allerdings ist die NO-Produktion bei 5 % der Krebserkrankungen beim Menschen um eine Größenordnung geringer. Unsere früheren Untersuchungen zeigen, dass NO-gesteuerte krebserregende Wege bei einer idealen Konzentration von 200–400 nM ablaufen, was die Expression von IL6 und IL8 erhöht [12]. Dennoch sind die NO-Werte dort höher, wo NOS2-exprimierende Zellen in einer viel höheren Dichte konzentriert sind, beispielsweise in lokalisierten Herden innerhalb des Tumors. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass diese Regionen hochdichter NOS2-exprimierender Zellen einen größeren NO-Fluss aufweisen, der onkogene Mechanismen auslösen kann, die im Bereich von 100–300 nM NO in der Petrischale ablaufen [32,33,34]. ].

Bereiche, die mit CD8+ T-Zellen und IFNγ angereichert sind, hängen mit der Nebeneinanderstellung von Lymph- und Tumorzellen innerhalb des TME zusammen, was zu einer starken Clusterbildung verstärkter NOS2-exprimierender Zellen führt. Eine frühere Studie, die sich mit der Platzierung von CD8+-T-Zellen befasste, zeigte, dass die räumliche Orientierung ein entscheidender Faktor bei der Bestimmung der klinischen TNBC-Ergebnisse ist [22]. Positive Ergebnisse werden beschrieben, wenn der Tumor bei einem vollständig entzündeten Tumor CD8+ T-Zellen tief in den Tumorkern eindringt. Andererseits sagen Stroma-eingeschränkte CD8+-T-Zellen und Immunwüstenregionen ohne CD8+-T-Zellen schlechte klinische Ergebnisse voraus [22]. Hier zeigen wir, dass sich am Tumorrand und in der Nähe von stromabeschränkten CD8+-T-Zellen zelluläre Nischen mit hohem NOS2-Gehalt bilden können. Diese Nischen können nun auf IFNγ und andere Zytokine treffen, die die Tumor-NOS2/COX2-Expression induzieren. Im Gegensatz dazu sind NOS2+- und COX2+-Zellen verstreut und werden in geringeren Mengen in Bereichen mit erhöhter Penetration von CD8+-T-Zellen in den Tumor beobachtet. Die oben genannten Informationen belegen eindeutig, dass CD8+-T-Zellen und IFNγ in der Nähe von NOS2 liegen und legen nahe, dass eine entzündliche Nische mit stromabeschränkten CD8+-T-Zellen für die NOS2-Induktion notwendig ist.

Eine Immunwüste ohne CD8+-T-Zellen ist ein weiterer wichtiger Aspekt des TME, der zuvor identifiziert wurde [22]. Ein schlechtes klinisches Ergebnis lässt auf niedrige CD8+-T-Zellzahlen und erschöpfte CD8+-T-Zellen im Tumorkompartiment schließen [35]. Einer der kritischen Faktoren für das Fehlen von CD8+ T-Zellen, die mit niedrigem IFNγ in immunologischen Wüstenregionen verbunden sind, wurde auch in Regionen mit NOS2-Mangel und erhöhter COX2-Expression entdeckt. Dies impliziert, dass die immunologische Wüste mit COX2-positiven und NOS2-negativen Regionen assoziiert ist. Erhöhte CD8+-T-Zellen und andere lymphoide Zellen, die auf das Tumorstroma oder die Tumorränder beschränkt sind, können zu Situationen führen, die höhere NOS2- und COX2-Werte fördern.

Unsere früheren Untersuchungen haben gezeigt, dass NO für die Förderung von EMT und Metastasierung unerlässlich ist [15]. Eine erhöhte Entzündung an diesen NOS2-Herden erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Metastasierung, und die Entdeckung der NOS2-positiven Nische an der Tumor-Stroma-Grenzfläche legt nahe, dass dies der Ort der Metastasierung sein könnte. Es ist bekannt, dass durch NO induzierte Dehnung und EMT diese Effekte vermitteln [15]. Außerdem verbessern IL1 und PGE2 die EMT und die Zellmotilität bei Brustkrebs [36, 37]. Dabei fördern IFNγ und ILβ1/TNFα die Motilität und Dehnung [7]. Infolgedessen erhöhen die NOS2/COX2-Entzündungsnischen das Potenzial für die Motilität von Krebszellen und die Ausbreitung von Metastasen. Daher kann durch Hemmung der NOS2/COX2-Feedforward-Schleifen ein begrenztes Metastasierungspotential erreicht werden [38]. Angesichts der Tatsache, dass Metastasierung die Hauptursache für Krebstodesfälle ist, könnte die räumliche Lokalisierung von NOS2/COX2 an diesen Entzündungsherden einen frühen prognostischen Indikator für ein schlechtes Ergebnis liefern, selbst wenn kein Lymphknoten-positiver Status vorliegt [7].

IFNγ spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion proinflammatorischer Antitumor-Immunantworten [39]. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass die IFNγ-Reaktion konzentrationsabhängig ist, wobei niedrige Werte im TME das Fortschreiten der protumorigenen Erkrankung fördern, was zum Teil durch die Herunterregulierung wichtiger Histokompatibilitätskomplexe und die Hochregulierung von Indoleamin-2,3-Dioxygenase und programmiertem Zelltodligand 1 vermittelt wird [39]. . Darüber hinaus ist IFNγ notwendig, um die tumorspezifische NOS2/COX2-Expression zu stimulieren, die über einen vielschichtigen Prozess auch onkogene Signalwege antreibt und immunologische Profile formt, die mit einer schlechten Prognose verbunden sind [10, 11]. Angesichts der Tatsache, dass IFNγ von zytolytischen CD8+-T-Zellen sezerniert wird, legt die räumliche Analyse nahe, dass die Menge und der Standort von CD8+-T-Zellen [22] eine Möglichkeit für die Bildung von IFNγ-Regulationsprozessen innerhalb des TME darstellen, einschließlich der Hochregulierung der NOS2/COX2-Expression im Tumor die Entwicklung von Nischen, die das Fortschreiten der Krankheit, Metastasierung und schlechte klinische Ergebnisse fördern [7, 10, 11, 22].

Die menschliche Brustkrebszelllinie MDA-MB231 (MB231) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) erhalten und in RPM1-1640 (Invitrogen), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Invitrogen, Waltham, MA) bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 in der Luft. Vor dem Experiment wurde den Zellen über Nacht das Serum entzogen. Abhängig von den nachgeschalteten Tests wurden die Zellen 12, 24 oder 48 Stunden lang unter Zugabe von ddH2O (Kontrolle), IFNγ 100 U/ml (285-IF/CF, R&D Systems, Minneapolis, MN) und IL1β 10 ng inkubiert /ml (201-LB/CF, R&D Systems), TNFα 10 ng/ml (210-TA/CF, R&D Systems), IL17A 10 ng/ml (7955-IL-CF, R&D Systems), Lipopolysaccharid (LPS, Sigma , St. Louis, MO) 10 mg/ml (L2630, Sigma), LNAME 500 mM (N5751, Sigma, St. Louis, MO) und/oder Indomethacin 100 μM (I7378, Sigma, St. Louis, MO).

Eine Million Zellen wurden in einer 60-mm-Schale ausplattiert und man ließ sie 100 % Konfluenz erreichen. Mit einer 200-μl-Pipettenspitze wurde eine gerade Ritzlinie über die konfluente Monoschicht geätzt. Schwimmende und tote Zellen wurden durch Waschen des Geschirrs in 1X PBS entfernt und anschließend wurde Vollmedium hinzugefügt. Ein 10-fach-Objektiv-Umkehrmikroskop (EVOS, Life Technologies, Carlsbad, CA) wurde verwendet, um Bilder nach 0, 4, 8 und 12 Stunden aufzunehmen. Die Open-Source-Software ImageJ hat die Geschwindigkeit gemessen, mit der Arbeitslücken wieder aufgefüllt werden (Version 1.53 u) [40].

Es wurde ein Zellinvasionstest (Kat.-Nr. ab235697) im 96-Well-Plattenformat von Abcam (Waltham, MA) verwendet. Nach der Zellsynchronisation wurde der unteren Kammer ein komplettes Medium als Lockstoff gegeben und 50.000 Zellen wurden in der oberen Kammer 48 Stunden lang mit Zytokinen ± Inhibitoren ausgesät. Migrierte fluoreszierende Zellen wurden bei Ex/EM = 530/590 nm auf einem SpectraMax i3x-Plattenlesegerät (Molecular Devices, San Jose, CA) gezählt und mit einer Standardkurve aus derselben Zelllinie verglichen.

Die Einzelzellbibliothek wurde mit dem 10x Genomics (San Francisco, CA) Single Cell 3' Reagent Kit v3 erstellt und dann in unserer Sequenzierungsanlage (NCI in Frederick, MD) mit einem Illumina NovaSeq 6000 sequenziert. Probenzellen in einem Suspensionsmedium wurden vor der Bibliotheksvorbereitung auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Die cDNAs wurden sequenziert, nachdem sie während der Bibliotheksvorbereitung mit einem Barcode versehen, gepoolt und amplifiziert worden waren. Im Durchschnitt wurden 10.000 Zellen pro Probe sequenziert. Die Cell Ranger-Software lieferte Rohdaten als Eingabe (10x Genomics, Version 6.1.2). Sie wurden mit dem Cell Ranger demultiplext und in BCL-Dateien konvertiert. Alle Messwerte wurden nach bestandener Qualitätsprüfung (GRCH38-30.0) mithilfe der standardmäßigen 10x Genomics Pipeline (Version 3.1.0) auf das menschliche Referenzgenom abgebildet. Annotierte Transkriptzahlen innerhalb jeder Zelle wurden verwendet, um UMI-Zählmatrizen (Unique Molecular Identifier) ​​zu erstellen.

Die Matrix-h5-Dateien für jede Probe wurden zur Datenverarbeitung und Datengewinnung auf den internen Flow-Server von Partek (St. Louis, MO) hochgeladen. Alle Zählungen wurden mit der Standardmethode „Zählungen pro Million, Addition 1 und Log2-Transformation“ normalisiert. Anschließend wurde das GSA-Tool (Genspezifische Analyse) eingesetzt, um Gene zu entdecken, die in den verschiedenen Versuchsproben unterschiedlich exprimiert wurden. Zur Auswahl der Gene wurden absolute Fold Changes ≥2 und ein ap-Wert <0,05 verwendet. Wir haben den Loupe Browser (Version 6.3.0, 10× Genomics) verwendet, um die aggregierten und eigenständigen Datensätze visuell zu untersuchen und die Clustermuster der scRNAseq-Daten zu analysieren. Um Korrelations-Heatmaps zu erstellen, wurden scRNAseq-Datensätze, die direkt in Seurat (Version 4.0, Satija-Labor, https://satijalab.org/seurat/) verarbeitet wurden, aus der Cell Ranger-Ausgabe nach RStudio (2022.07.2 Build 576, https) exportiert ://posit.co/) parallel. Einzelzelldaten sind auf Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Der Zugriff auf die Brustkrebs-Untergruppe (BRCA) von TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga) erfolgte über die UCSC (University of California, Santa Cruz) Xena Browser (Zugriffsdatum: 02.11.2022, https://xena.ucsc.edu/). Kurz gesagt, alle gezielten Th1-, Th2-, Th17-Zytokine, NOS2- und COX2-Gene wurden im Xena-Browser untersucht und dann zur anschließenden Korrelationsanalyse nach RStudio (2022.07.2 Build 576) exportiert.

Tumorproben (n = 21) wurden von Brustkrebspatientinnen entnommen, die zwischen 1993 und 2003 am University of Maryland (UMD) Medical Center, am Baltimore Veterans Affairs Medical Center, am Union Memorial Hospital, am Mercy Medical Center und am Sinai Hospital in Baltimore rekrutiert wurden . Die Einverständniserklärung aller Patienten wurde eingeholt. Die Sammlung von Tumorproben, Umfragedaten sowie klinischen und pathologischen Informationen (UMD-Protokoll Nr. 0298229) wurde vom UMD Institutional Review Board (IRB) für die teilnehmenden Institutionen überprüft und genehmigt. Die Forschung wurde auch vom NIH Office of Human Subjects Research (OHSR-Nr. 2248) geprüft und genehmigt. Die NOS2- und COX2-Expression des Brusttumors wurde zuvor von IHC unter Verwendung von 1:250 verdünntem NOS2-Antikörper und 1:50 verdünntem COX2-Antikörper (Nr. 610328 bzw. 610204, BD Biosciences, San Diego, CA) analysiert und von einem Pathologen bewertet [7, 9]. Für die NOS2-Färbung wurde eine Kombination aus Intensität und Verteilung verwendet, um die immunhistochemischen NOS2-Färbungen zu kategorisieren, wobei die Intensität einen Wert von 0–3 erhielt, wenn die Färbung negativ, schwach, mäßig oder stark war. Die NOS2-Verteilung erhielt Werte von 0–4 für Verteilungen <10 %, 10–30 %, >30–50 %, >50–80 % und >80 % positive Zellen [7]. Für die COX2-Färbung wurden die Werte negativ bis schwach [1, 2] oder mäßig bis stark [3, 4] als niedrig bzw. hoch eingestuft [9]. Hierin wurden die NOS2- und COX2-Expressionen auch durch Fluoreszenzfärbung analysiert, die auf dem Bond RX Autostainer XL ST5010 von Leica Biosystems (Wetzlar, Deutschland) unter Verwendung des Bond Polymer Refine Kit (Leica Biosystems DS9800) durchgeführt wurde, wobei das Post Primary Block-Reagenz DAB weggelassen wurde und Hämatoxylin. Nach der Antigengewinnung mit EDTA (Bond Epitope Retrieval 2) wurden die Schnitte 30 Minuten lang mit COX2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Nr. 12282, 1:100) inkubiert, gefolgt von dem Polymerreagenz und OPAL Fluorophor 520 (AKOYA, Marlborough, MA). Der COX2-Antikörperkomplex wurde durch Erhitzen mit Bond Epitope Retrieval 2 entfernt. Die Schnitte wurden dann 30 Minuten lang mit NOS2-Antikörper (Abcam Nr. ab15323, 1:50) inkubiert, gefolgt von dem Polymerreagenz und OPAL Fluorophor 690. Der NOS2-Antikörperkomplex wurde entfernt durch Erhitzen mit Bond Epitope Retrieval 2 entfernt und dann mit CD8 (Abcam Nr. 101500, 1:100) oder IFNγ (Abcam Nr. 231036, 1:200) gefärbt, gefolgt von dem Polymerreagenz und OPAL Fluorophor 570. Die Schnitte wurden mit gefärbt DAPI und mit Prolong Gold Anti-Fade Reagent (Invitrogen) abgedeckt. Die Bilder wurden mit dem Ganzdiascanner Aperio ScanScope FL (Leica) aufgenommen. Die ursprünglich von der IHC zuvor berichteten Ergebnisse [7, 9] und die Ergebnisse der Fluoreszenz-NOS2/COX2-Färbung waren im Allgemeinen konsistent.

Formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe, das bei 4 μm geschnitten und auf SuperFrost Plus-Objektträgern montiert wurde, wurde mit einem FixVUE Immuno-8TM Kit (früher als UltiMapper® Kits bezeichnet (Ultivue Inc., Cambridge, MA), USA; CD8) gefärbt , NOS2, COX2, CKSOX10 und IFNγ-Cocktail) unter Verwendung der Antikörper-konjugierten DNA-Barcode-Multiplex-Immunfluoreszenzmethode (mIF) [1]. Diese Kits enthalten die erforderlichen Puffer und Reagenzien zur Durchführung der Tests: Antikörperverdünnungsmittel, Voramplifikationsmischung, Amplifikationsenzym und -puffer, Fluoreszenzsonden und entsprechender Puffer sowie nukleäres Gegenfärbereagenz. Die Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und mIF-Färbung wurde mit dem BOND RX Autostainer von Leica Biosystems durchgeführt. Vor der mIF-Färbung wurden FFPE-Gewebeschnitte 30 Minuten lang vertikal bei 60–65 °C gebacken, um überschüssiges Paraffin vor dem Laden auf den BOND RX zu entfernen. Der BOND RX wurde zum Färben der Objektträger mit dem empfohlenen FixVUE-Protokoll (UltiMapper) verwendet. Während des Assayaufbaus wurden die Reagenzien aus dem Kit vorbereitet und in Leica Titrationsbehältern auf den Autostainer geladen. Lösungen für die Epitop-Retrieval (ER2, Leica Biosystems Kat.-Nr. AR9640), BOND Wash (Leica Biosystems Kat.-Nr. AR9590) sowie alle anderen BOND RX-Massenreagenzien wurden von Leica erworben. Bei diesem Assay wurde die Probe zunächst mit einer Mischung aller vier Antikörperkonjugate inkubiert, anschließend wurden die DNA-Barcodes jedes Ziels gleichzeitig amplifiziert, um die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Anschließend wurden der Probe fluoreszierende Sonden zugesetzt, die mit komplementären DNA-Barcodes konjugiert waren, um die Ziele zu binden und zu markieren. Als nächstes wurde ein sanfter Signalentfernungsschritt durchgeführt, um die Fluoreszenzsonden der Marker zu entfernen. Die gefärbten Objektträger wurden in Prolong Gold Anti-Fade-Eindeckmittel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Kat.-Nr. P36965) eingelegt und abgedeckt (Fisherbrand-Deckglas 22 × 40 mm, Nr. 1,5). Digitale Immunfluoreszenzbilder wurden mit 20-facher Vergrößerung gescannt. Bilder wurden mit der Ultivue UltiStacker-Software gemeinsam registriert und gestapelt. Die digitalen Bilder wurden dann mit der HALO-Bildanalyseplattform analysiert [41].

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Experimente dreifach durchgeführt. Der Student-T-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz mithilfe der GraphPad Prism-Software (Version 9) zu bewerten. Bildanalysen werden als Mittelwert ± SEM angegeben und T-Tests mit Welch- oder Mann-Whitney-Korrektur wurden gegebenenfalls zur Bestimmung der Signifikanz verwendet. Mithilfe der Prism-Software wurden auch lineare Analysen und Pearson-Korrelationen durchgeführt, um signifikante Korrelationen zwischen Proteinexpressionen zu ermitteln. Die Signifikanz wird als *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 und ****p ≤ 0,0001 angegeben. Einzelzellkorrelationsanalysen wurden in RStudio unter Verwendung des Corrplots (0,92) in R (4.2.1) durchgeführt.

Einzelzell-RNAseq-Daten werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

Putti TC, El-Rehim DM, Rakha EA, Paish CE, Lee AH, Pinder SE, et al. Östrogenrezeptor-negative Brustkarzinome: eine Überprüfung der Morphologie und immunphänotypischen Analyse. Mod Pathol. 2005;18:26–35.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Poddar A, Rao SR, Prithviraj P, Kannourakis G, Jayachandran A. Crosstalk zwischen Immun-Checkpoint-Modulatoren, metabolischer Reprogrammierung und zellulärer Plastizität bei dreifach negativem Brustkrebs. Curr Oncol. 2022;29:6847–63.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas DD, Wink DA. NOS2 als aufstrebender Akteur bei der Progression von Krebs. Antioxid-Redox-Signal. 2017;26:963–5.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carvalho LAC, Queijo RG, Baccaro ALB, Siena ADD, Silva WA, Jr, Rodrigues T, et al. Redox-bezogene Proteine ​​bei der Melanomprogression. Antioxidantien. 2022;11:438.

Douguet L, Bod L, Labarthe L, Lengagne R, Kato M, Couillin I, et al. Eine Entzündung treibt die Expression der Stickoxidsynthase 2 durch Gammadelta-T-Zellen voran und beeinflusst das Gleichgewicht zwischen Melanomen und Vitiligo-assoziierten Melanomen. Onkoimmunologie. 2018;7:e1484979.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Palumbo P, Lombardi F, Augello FR, Giusti I, Luzzi S, Dolo V, et al. NOS2-Inhibitor 1400W Induziert den autophagischen Fluss und beeinflusst das extrazelluläre Vesikelprofil in der menschlichen Glioblastom-Zelllinie U87MG. Int J Mol Sci. 2019;20:3010

Glynn SA, Boersma BJ, Dorsey TH, Yi M, Yfantis HG, Ridnour LA, et al. Erhöhtes NOS2 lässt auf ein schlechtes Überleben bei Östrogenrezeptor-negativen Brustkrebspatientinnen schließen. J Clin Invest. 2010;120:3843–54.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng RYS, Burkett S, Ambs S, Moody T, Wink DA, Ridnour LA. Chronische Stickstoffmonoxid-Exposition führt zu P53-Mutationen und bösartigen Merkmalen in menschlichen Brustepithelzellen. Biomoleküle. 2023;13:311.

Glynn SA, Prueitt RL, Ridnour LA, Boersma BJ, Dorsey TM, Wink DA, et al. Die COX-2-Aktivierung ist mit der Akt-Phosphorylierung und einem schlechten Überleben bei ER-negativem, HER2-positivem Brustkrebs verbunden. BMC-Krebs. 2010;10:626.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D, Glynn SA, Greer M, Somasundaram V, No JH, Scheiblin DA, et al. Die Koexpression von NOS2 und COX2 beschleunigt das Tumorwachstum und verringert die Überlebensrate bei Östrogenrezeptor-negativem Brustkrebs. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:13030–5.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Somasundaram V, Ridnour LA, Cheng RY, Walke AJ, Kedei N, Bhattacharyya DD, et al. Systemische Nos2-Depletion und Cox-Hemmung begrenzen das Fortschreiten der TNBC-Erkrankung und verändern die räumliche Ausrichtung und Dichte der Lymphzellen. Redox-Biol. 2022;58:102529.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D, Bharadwaj G, Somasundaram V, Cheng RYS, Ridnour LA, Fujita M, et al. Verständnis des Kommunikationsnetzwerks der Tumormikroumgebung aus der NOS2/COX2-Perspektive. Br J Pharm. 2019;176:155–76.

Artikel CAS Google Scholar

Somasundaram V, Gilmore AC, Basudhar D, Palmieri EM, Scheiblin DA, Heinz WF, et al. Der induzierbare, von der Stickoxidsynthase abgeleitete extrazelluläre Stickoxidfluss reguliert proinflammatorische Reaktionen auf Einzelzellebene. Redox-Biol. 2020;28:101354.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Angeloni V, Tiberio P, Appierto V, Daidone MG. Auswirkungen stammbezogener Signalwege auf die Reaktion von Brustkrebs auf die Therapie. Semin Cancer Biol. 2015;31:43–51.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Heinecke JL, Ridnour LA, Cheng RY, Switzer CH, Lizardo MM, Khanna C, et al. Auf der Tumormikroumgebung basierende Feed-Forward-Regulation von NOS2 beim Fortschreiten des Brustkrebses. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111;6323–8.

Takawale A, Zhang P, Patel VB, Wang Hypertonie. 2017;69:1092–103.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu TC, Xu K, Martinek J, Young RR, Banchereau R, George J, et al. Der IL1-Rezeptorantagonist kontrolliert die Transkriptionssignatur der Entzündung bei Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs. Krebs Res. 2018;78:5243–58.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun X, Zhai J, Sun B, Parra ER, Jiang M, Ma W, et al. Zytotoxische CD3(+)/CD8(+)/CD45RO(+)-T-Zellen mit Effektorgedächtnis weisen auf ein gutes Überleben und ein geringeres Risiko eines erneuten Auftretens bei dreifach negativem Brustkrebs hin. Mod Pathol. 2022;35:601–8.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang G, Xu Q, Zhang X, Yang M, Wang Y, He M, et al. Räumliche zytotoxische und Gedächtnis-T-Zellen im Tumor sagen bessere Überlebensergebnisse bei Patienten mit hochgradigem serösem Eierstockkrebs voraus. Krebsmed. 2021;10:3905–18.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prizment AE, Vierkant RA, Smyrk TC, Tillmans LS, Nelson HH, Lynch CF, et al. Zytotoxische T-Zellen und Granzym B assoziierten mit einem verbesserten Überleben bei Darmkrebs in einer prospektiven Kohorte älterer Frauen. Krebs Epidemiol Biomark Vorher. 2017;26:622–31.

Artikel CAS Google Scholar

Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: Open-Source-Software für die Bildanalyse in der digitalen Pathologie. Sci Rep. 2017;7:16878.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gruosso T, Gigoux M, Manem VSK, Bertos N, Zuo D, Perlitch I, et al. Räumlich unterschiedliche Tumorimmun-Mikroumgebungen schichten dreifach negative Brustkrebserkrankungen. J Clin Invest. 2019;129:1785–800.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D, Somasundaram V, de Oliveira GA, Kesarwala A, Heinecke JL, Cheng RY, et al. Von der Stickstoffmonoxid-Synthase-2 abgeleitetes Stickstoffmonoxid steuert mehrere Wege des Fortschreitens von Brustkrebs. Antioxid-Redox-Signal. 2017;26:1044–58.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wink DA, Ridnour LA, Cheng R, Switzer CW, Glynn S, Ambs S. Die onkogenen Eigenschaften der durch Redox-Entzündungsprotein induzierbaren Stickoxidsynthase bei ER(-)-Brustkrebs. Redox-Biol. 2015;5:413.

Artikel PubMed Google Scholar

Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Qian W, et al. Hemmung von iNOS als neuartige wirksame gezielte Therapie gegen dreifach negativen Brustkrebs. Brustkrebs Res. 2015;17:25.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsh EM, Keane MM, Wink DA, Callagy G, Glynn SA. Übersicht über dreifach negativen Brustkrebs und den Einfluss der induzierbaren Stickoxidsynthase auf die Tumorbiologie und die Patientenergebnisse. Crit Rev Oncog. 2016;21:333–51.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun S, Zhi Z, Su Y, Sun J, Li Q. Ein CD8+ T-Zell-assoziiertes Immungen-Panel zur Vorhersage der Prognose und der immuntherapeutischen Wirkung von Melanomen. Frontimmunol. 2022;13:1039565.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kleinert H, Wallerath T, Fritz G, Ihrig-Biedert I, Rodriguez-Pascual F, Geller DA, et al. Zytokin-Induktion von NO-Synthase II in menschlichen DLD-1-Zellen: Rollen der JAK-STAT-, AP-1- und NF-kappaB-Signalwege. Br J Pharm. 1998;125:193–201.

Artikel CAS Google Scholar

Hoos MD, Vitek MP, Ridnour LA, Wilson J, Jansen M, Everhart A, et al. Der Einfluss von Unterschieden zwischen Mensch und Maus in der NOS2-Genexpression auf die Redox- und Immunumgebung des Gehirns. Mol Neurodegener. 2014;9:50.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zamora R, Vodovotz Y, Billiar TR. Induzierbare Stickoxidsynthase und entzündliche Erkrankungen. Mol Med. 2000;6:347–73.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lancaster JR Jr. Simulation der Diffusion und Reaktion von endogen produziertem Stickoxid. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:8137–41.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Switzer CH, Cheng RY, Ridnour LA, Glynn SA, Ambs S, Wink DA. Ets-1 ist ein Transkriptionsmediator der onkogenen Stickoxidsignalisierung bei Östrogenrezeptor-negativem Brustkrebs. Brustkrebs Res. 2012;14:R125.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Switzer CH, Glynn SA, Cheng RY, Ridnour LA, Green JE, Ambs S, et al. Die S-Nitrosylierung von EGFR und Src aktiviert ein onkogenes Signalnetzwerk bei menschlichem basalähnlichem Brustkrebs. Mol Cancer Res. 2012;10;1203–15.

Switzer CH, Ridnour LA, Cheng R, Heinecke J, Burke A, Glynn S, et al. S-Nitrosierung vermittelt mehrere Wege, die zur Tumorprogression bei Östrogenrezeptor-negativem Brustkrebs führen. Immunopathol Dis Ther. 2012;3:117–24.

Artikel Google Scholar

Egelston CA, Guo W, Tan J, Avalos C, Simons DL, Lim MH, et al. Tumorinfiltrierende erschöpfte CD8+-T-Zellen führen zu einer verringerten Überlebensrate bei prämenopausalem Östrogenrezeptor-positivem Brustkrebs. JCI Insight. 2022;7:e153963

Tulotta C, Lefley DV, Freeman K, Gregory WM, Hanby AM, Heath PR, et al. Die endogene Produktion von IL1B durch Brustkrebszellen treibt die Metastasierung und Kolonisierung der Knochenmikroumgebung voran. Clin Cancer Res. 2019;25:2769–82.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Walker OL, Dahn ML, Power, Coombs MR, Marcato P. Der Prostaglandin-E2-Signalweg und Brustkrebsstammzellen: Hinweise auf eine erhöhte Signalübertragung und potenzielles Targeting. Front Oncol. 2021;11:791696.

Artikel PubMed Google Scholar

Chung AW, Anand K, Anselme AC, Chan AA, Gupta N, Venta LA, et al. Eine klinische Phase-1/2-Studie mit dem Stickoxid-Synthase-Inhibitor L-NMMA und Taxan zur Behandlung von chemoresistentem dreifach negativem Brustkrebs. Sci Transl Med. 2021;13:eabj5070.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Rollen von IFN-gamma bei der Tumorprogression und -regression: eine Übersicht. Biomark Res. 2020;8:49.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liang CC, Park AY, Guan JL. In-vitro-Scratch-Assay: eine praktische und kostengünstige Methode zur Analyse der Zellmigration in vitro. Nat-Protokoll. 2007;2:329–33.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manesse M, Patel KK, Bobrow M, Downing SR. Die InSituPlex((R))-Färbemethode für die Multiplex-Immunfluoreszenz-Zellphänotypisierung und räumliche Profilierung von Tumor-FFPE-Proben. Methoden Mol Biol. 2020;2055:585–92.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln aus dem Intramural Research Program des NIH, National Cancer Institute, CCR, CIL (RYSC, LAR, ALG, ELF, HR, VS, RJK, SMH, DWM, SKA, SA) finanziert , und DAW). Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln des Frederick National Laboratory for Cancer Research, National Institutes of Health, im Rahmen des Vertrags HHSN261200800001E (ALW, WFH, MP, SKA und SJL) und des Basic Science Program des Frederick National Laboratory for Cancer Research finanziert , Frederick, MD 21702 (SKA). Dieses Projekt wurde teilweise durch die Zuschüsse 2018/08107-2 und 2021/14642-0 (MCR) der São Paulo Research Foundation (FAPESP), NIH R01CA238727, NIH U01CA253553 und John S Dunn Research Foundation (STCW), NCI-Zuschuss-Nr. finanziert. U54 CA210181, die Breast Cancer Research Foundation (BCRF), die Moran Foundation, Causes for a Cure, philanthropische Unterstützung von M. Neal und R. Neal und das Center for Drug Repositioning and Development Program (CREDO) (JCC), Science Foundation Irland (SFI)-Zuschussnummer 17/CDA/4638 und ein SFI- und Europäischer Fonds für regionale Entwicklung (EFRE)-Zuschussnummer 13/RC/2073 (SAG). Wir möchten der São Paulo Research Foundation (FAPESP) für die Entsendung von Studierenden ins Ausland (LC) danken. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Ministeriums für Gesundheit und menschliche Dienste wider, und die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen impliziert auch keine Billigung durch die US-Regierung.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Robert YS Cheng, Lisa A. Ridnour.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Stephen J. Lockett, Stefan Ambs, David A. Wink.

Cancer Innovation Laboratory, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Frederick, MD, USA

Robert YS Cheng, Lisa A. Ridnour, Ana L. Gonzalez, Elise L. Femino, Helene Rittscher, Veena Somasundaram, Daniel W. McVicar, Stephen K. Anderson und David A. Wink

Labor für optische Mikroskopie und Analyse, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc. für das National Cancer Institute, Frederick, MD, USA

Adelaide L. Wink, William F. Heinz und Stephen J. Lockett

Zentrum für translationale Forschung in der Onkologie, ICESP/HC, Medizinische Fakultät, Universität São Paulo; und umfassendes Zentrum für Präzisionsonkologie, Universität Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasilien

Leandro Coutinho & M. Cristina Rangel

Molecular Histopathology Laboratories, Leidos Biomedical Research Inc. für NCI, Frederick, MD, USA

Elijah F. Edmondson und Donna Butcher

Büro des Direktors, Abteilung für Krebsbehandlung und -diagnose, NCI, Frederick, MD, USA

Robert J. Kinder

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Emory University, Atlanta, GA, USA

Xiaoxian Li

Abteilung für Systemmedizin und Bioingenieurwesen, Houston Methodist Neal Cancer Center, Houston Methodist Hospital und Weill Cornell Medicine, Houston, TX, USA

Stephen TC Wong

Labor für bildgebende Massenzytometrie, Programm für Krebsforschungstechnologie, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Frederick, MD, USA

Milind Pore

Labor für Pathologie CCR, NCI, NIH, Bethesda, MD, USA

Stephen M. Hewitt

Abteilung für Chirurgie, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA, 15213, USA

Timothy R. Billiar

Fachgebiet Pathologie, Lambe Institute for Translational Research, School of Medicine, University of Galway, Galway, Irland

Sharon A. Glynn

Mary und Ron Neal Cancer Center, Houston Methodist Hospital und Weill Cornell Medicine, Houston, TX, USA

Jenny C. Chang

Labor für menschliche Karzinogenese, CCR, NCI, NIH, Bethesda, MD, USA

Stefan Ambs

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RYSC und LAR: haben Aufsätze geschrieben, Experimente durchgeführt und Datenanalysen durchgeführt. ALW: analysierte Daten. ALG, ELF, LC, MP, SMH und SA: Experimente und Datenanalyse durchgeführt. HR, VS und DB: durchgeführte Experimente. WFH, EFE, RJK, XL, STCW, DWM, SKA, TRB, SAG, JCC und SJL: Datenanalyse. MCR: bereitgestellte Reagenzien. DAW: verfasste Artikel und Datenanalyse.

Korrespondenz mit David A. Wink.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Herausgegeben von Dr. Pier Giorgio Mastroberardino

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Cheng, RYS, Ridnour, LA, Wink, AL et al. Interferon-gamma ist für die NOS2- und COX2-Expression in ER-Brusttumoren von entscheidender Bedeutung, die zu schlechten Ergebnissen führen. Cell Death Dis 14, 319 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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Eingegangen: 05. Dezember 2022

Überarbeitet: 20. April 2023

Angenommen: 24. April 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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