Mechanische Eigenschaften, Sklerotisierungsgrad und elementare Zusammensetzung der Magenmühle im Roten Sumpfkrebs Procambarus clarkii (Decapoda, Crustacea)

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17799 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Magenmühle von Decapoda ist ein einzigartiges Merkmal, das Zähne, stabilisierende Gehörknöchelchen und Partikelsortierborsten umfasst. Diese Struktur ist an der Fragmentierung und Sortierung der Nahrung beteiligt und dient als Schnittstelle zwischen dem Organismus und seiner Umwelt. Da Materialeigenschaften die Morphologie ergänzen und Informationen über Funktion und trophische Präferenzen enthalten, bieten wir hier eine Grundlage für vergleichende Untersuchungen zu Magenmühlen. Für Magenmühlenbestandteile des erwachsenen Roten Sumpfkrebses Procambarus clarkii untersuchten wir (a) die Mikrostruktur mittels Rasterelektronenmikroskopie, (b) die Elementzusammensetzung mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie, (c) die Heterogenitäten in den Materialeigenschaften und Bräunungsgrad (Autofluoreszenz) durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und (d) die mechanischen Eigenschaften Härte und Elastizität durch Nanoindentationstechnik. Die Morphologie und Mikrostruktur dieser Art wurden zuvor beschrieben, die mechanischen Eigenschaften und die Autofluoreszenz wurden jedoch bisher nicht untersucht. Da Epicuticula und Exocuticula einzeln analysiert werden konnten, konnten Materialeigenschaftsgradienten bestimmt werden, deren Werte von der interagierenden Oberfläche zum Inneren hin abnehmen. Schließlich konnten wir die mechanischen Eigenschaftsdaten mit der Elementzusammensetzung und dem Bräunungsgrad in Beziehung setzen. Wir fanden heraus, dass die Epikutikula der Zähne aufgrund des hohen Anteils an Silizium zu den härtesten und steifsten biologischen Materialien bei Wirbellosen gehört.

Innerhalb der Arthropoda weisen die Krebstiere mit etwa 67.000 beschriebenen Arten eine außergewöhnliche Vielfalt an Körperbauplänen auf, die es ihnen ermöglichte, nahezu alle Lebensräume zu besiedeln1. Damit einher geht die Fähigkeit, eine Vielzahl von Nahrungsarten mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften zu fressen2,3 und die Entwicklung spezialisierter Anhängsel wie Mandibeln, Oberkiefer oder Maxilipedien, die die Nahrung mechanisch verarbeiten2,4,5,6,7. Darüber hinaus entwickelten die Decapoda einen spezialisierten und komplexen Vorderdarm, der neben der Speiseröhre auch das Herz und die Pyloruskammer des Magens umfasst. Die Herzkammer speichert die aufgenommene Nahrung und zerkleinert sie zusätzlich mechanisch. Dies geschieht durch eine komplexe Anordnung stabilisierender Gehörknöchelchen und interagierender Zähne, die als „Magenmühle“ bezeichnet wurden [z. B. 8,9,10,11,12]. Nach der Fragmentierung werden Nahrungspartikel in die Pyloruskammer transportiert und passieren dabei die Herzklappen, die als Barriere und Kauknöchelchen fungieren4. Die Pyloruskammer ist mit Borsten bedeckt, die es nur feinen Partikeln ermöglichen, die Mitteldarmdrüsen zu erreichen und grobe Partikel in den Hinterdarm zu verteilen.

Bezüglich der Bestandteile der Magenmühle wurden hervorragende anatomische, morphologische und elementare Analysen durchgeführt13,14,15,16. Darüber hinaus wurde die Magenmühle im Hinblick auf Altersbestimmung17,18,19,20,21 und Kommunikation22 untersucht. Da dieser Teil des Magens morphologisch vielfältig ist23,24, löste dies eine anhaltende Diskussion aus25, inwieweit die Formen der Magenmühlenkomponenten Anpassungen an Nahrungsmittel und Ernährungsgewohnheiten widerspiegeln4,10,26,27,28,29,30,31, 32 oder phylogenetische Einschränkungen4,5,33,34,35.

Anpassungen an Lebensmittel spiegeln sich jedoch nicht nur in der Morphologie der Lebensmittelverarbeitungsstrukturen wider, sondern auch in deren Materialeigenschaften. Biologische Materialien sind das Ergebnis einer langjährigen Evolution und im Allgemeinen Verbundstoffe mit Heterogenitäten oder Gradienten, die zur Funktion beitragen [zur Übersicht siehe36]. Kenntnisse über Materialeigenschaften ergänzen die Morphologie und führen zu einem tiefgreifenden Verständnis der Funktion und – bei vergleichender Untersuchung von Nahrungsstrukturen – auch der trophischen Spezialisierungen. Bei den Nahrungsstrukturen von Wirbellosen berücksichtigen nur sehr wenige Studien, die mehrere Taxa im Lichte der trophischen Spezialisierung vergleichen, sowohl Materialeigenschaften als auch Morphologie [für Fliegenzähne siehe 37; für Schmetterlingsrüssel siehe38 und für Radularzähne siehe39,40,41,42,43.

Im Folgenden bieten wir eine Grundlage für weitere vergleichende Untersuchungen zu den Materialeigenschaften von Magenmühlen. Wir präsentieren Daten zur Epi- und Exokutikula von Magenmühlenbestandteilen ausgewachsener Roter Sumpfkrebse Procambarus clarkii (Girard, 1852) (Decapoda, Crustacea). Diese Art frisst im Vor- und Erwachsenenstadium eher pflanzenfressend und im Jugendstadium eher fleischfressend44. Zuvor wurden die Morphologie, Mikrostruktur und Elementzusammensetzung der Magenmühle dieser Art während der Intermolt-Phase untersucht13, es liegen jedoch Daten zu (a) den mechanischen Eigenschaften (Härte und Elastizitätsmodul) und (b) der lokalen Zusammensetzung des Chitins vor Schichten fehlen.

(A) Zunächst untersuchten wir die Mikrostruktur der Magenmühlenkomponenten, um Epi-, Exo- und Endokutikel zu identifizieren. Dies geschah durch Fragmentierung der Komponenten und anschließende sorgfältige Untersuchung unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM). (B) Anschließend verwendeten wir energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS, EDX), um die Elementzusammensetzung der Epi- und Exokutikula in den Zielstrukturen zu bestimmen. Diese Analysen wurden durchgeführt, um die Ursprünge der Heterogenitäten in den mechanischen Eigenschaften Härte und Elastizität (dh Young-Modul) zu bestimmen, die durch die Nanoindentationstechnik (C) identifiziert wurden. (D) Wir haben die Strukturen zusätzlich durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) mit vier Lasern unterschiedlicher Wellenlänge sichtbar gemacht. Das verwendete Protokoll wurde zuvor auf verschiedene Arthropodenstrukturen angewendet und konnte das Autofluoreszenzsignal mit dem Bräunungsgrad und dem organischen Gehalt in Beziehung setzen. Schließlich konnten wir die mechanischen Eigenschaftsdaten und die Autofluoreszenzsignale der Kutikula mit der Elementzusammensetzung und dem Bräunungsgrad in Beziehung setzen.

Die Tiere wurden im Jahr 2021 im Zuge des invasiven Artenmanagements auf Grundlage der aktualisierten EU-Verordnung 1143/2014 aus Süßwasserkörpern in Berlin, Deutschland, gesammelt. Sie wurden getötet, in 70 % EtOH fixiert und vom Fachbereich Biologie (Universität Hamburg) für den jährlichen Präparierkurs erworben. Dabei wurden erwachsene Exemplare ähnlicher Größe (11–12 cm) von den Studierenden präpariert, die intakten Mägen entnommen und erneut in 70 % EtOH gelagert. Für diese Studie wurden 18 Mägen ausgewählt. Das umliegende Gewebe wurde vorsichtig entfernt, die Mägen geöffnet, durch ein kurzes Ultraschallbad gereinigt und schließlich in EtOH gelagert.

Wir konzentrieren uns in dieser Studie auf insgesamt neun Magenmühlenstrukturen: den akzessorischen Zahn, die Herzklappe, den lateralen Zahn, das laterale Herzknöchelchen, den medialen Zahn, die Membran aus verschiedenen Magenbereichen, das Pterokardiaknöchelchen, die Setae aus verschiedenen Bereichen, und das Jochbein. Insgesamt haben wir 18 Mägen untersucht; Alle wurden zunächst lichtmikroskopisch dokumentiert, wobei ein Keyence-Digitalmikroskop VHX-7000 (KEYENCE, Neu-Isenburg, Deutschland) mit automatischer Stapelsoftware zum Einsatz kam (Abb. 1). Strukturen wurden entsprechend der bisherigen Literatur14,45,46,47,48 benannt (siehe Abb. 1). Teile (z. B. medialer Zahn, lateraler Zahn, Gehörknöchelchen usw.) von fünf weiteren Mägen wurden mit einer steifen Pinzette fragmentiert, um die geschichtete Organisation der Kutikula durch Lichtmikroskopie zu untersuchen (ergänzende Abbildung 1).

Lichtmikroskopische Bilder aus der Magenmühle von Procambarus clarkii. (A) Präparierte Magenmühle (rote Buchstaben markieren die Lokalitäten der getesteten Membran und rote Zahlen – die Lokalitäten der getesteten Setae; der Pfeil zeigt in die vordere, hintere und seitliche Richtung. (B) Seitenzahn. (C) Magen Mühle mit interagierenden lateralen Zähnen. (D) Medialer Zahn. (E) Nebenzahn. Ein anteriorer, AC-vorderer Höcker des Seitenzahns, AT-Nebenzahn, CC-Herzkammer, CV-Herzklappe, HI-Scharnier des medialen Zahns, IO untere Ampulle Gehörknöchelchen, L lateral, LC lateraler Höcker des lateralen Zahns, LcO laterales Herzknöchelchen, LS laterale Stacheln des medialen Zahns, LT lateraler Zahn, M Membran, MT medialer Zahn, P posterior, PC Pyloruskammer, PL Platte des medialen Zahns, PO pektineales Gehörknöchelchen, PP hinterer Fortsatz des medialen Zahns, PrO präpterokardiales Gehörknöchelchen, PtO pterokardiales Gehörknöchelchen, PyO pylorisches Gehörknöchelchen, RI Grate des lateralen Zahns, S Setae, UO urokardiales Gehörknöchelchen, VC ventraler Höcker des lateralen Zahns, ZO zygokardiales Gehörknöchelchen. Maßstabsbalken: A, 3000 µm; B, 400 um; C, 2000 um; D, 1 mm; E, 800 µm.

Nach der Lichtmikroskopie wurden die Bestandteile der fragmentierten Mägen und von sechs intakten Mägen mittels REM untersucht (Abb. 2, 3). Für REM-Bilder wurden Strukturen auf REM-Probenhaltern angeordnet, mit Platin sputterbeschichtet (5 nm Schicht) und mit dem Zeiss LEO 1525 (One Zeiss Drive, Thornwood, USA) dokumentiert, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten.

REM-Bilder. (A)–(C) Medialer Zahn mit Vergrößerungen der Zahnoberfläche (B–C). (D)–(E) Seitenzahn und seine Fraktur in starker Vergrößerung (E) der Epikutikula und der fibrösen Exokutikula. (F) Nebenzahn. (G)–(M) Chitinfaserstruktur der seitlichen Zahnbasis. (J) Fasern sind spiralförmig gebogen. (K)–(L) Schichtstruktur der Exokutikula bei niedrigen und hohen Vergrößerungen (L). M. Orientierung der Chitinfasern in der Exokutikula. (N) Gebrochener medialer Zahn mit möglichen Frakturartefakten zwischen den Fasern. (O) Unreifer Seitenzahn. EN-Endokutikel, EP-Epikutikel, EX-Exokutikel. Maßstabsbalken: A, 800 µm; B–C, H, 30 µm; D, 600 µm; E, I, 20 µm; F, 100 µm; G, 400 µm; J, 2 µm; K, 30 µm; L, 600 nm; M, 10 µm; N, 1 um; O, 400 µm.

REM-Bilder der Setae aus verschiedenen Fundorten (die Fundortnummer ist rot hervorgehoben). (A) Vermutlich spitz zulaufende Borsten mit kräftigem Schaft und Spitze, die kleine Vorsprünge aus Fundort 1 tragen, mit Vergrößerungen (B)–(D). (D, I) Befestigung der Setae an der Membran; Es war keine Steckdose zu sehen. (E) Setae [auch bei hohen Vergrößerungen (F)–(I)] mit langen gezackten Setules (plumodenticulate setae), die sich zusammenballten und ein Netz bildeten, aus dem Fundort 2. (J) Aus dem Fundort 4, lange Setae [mit Vergrößerungen (K)–(L)] ohne Zähnchengruppen, die sich zu Matten zusammenballen. (M) Aus dem Ort 6; lange Setae [bei starker Vergrößerung (N)] mit kleinen Schuppen (Pappose Setae). (O) Setae mit kleinen Vorsprüngen an der Spitze aus Fundort 7. Maßstabsbalken: A, E, 400 µm; B, 80 µm; C, F, 40 µm; D, 8 µm; E, H, K, 20 µm; F, 100 µm; G, L, 3 µm; I, N, 6 µm; J, 200 µm; K, 20 µm; M, 200 nm; O, 2 µm.

Für die Kutikula von Arthropoden ermöglichte die Laseranregung über CLSM gemäß dem Protokoll von49 die Identifizierung von Regionen mit den folgenden Materialzusammensetzungen: sklerotisierte, steife Kutikula ist mit einem roten Signal und schwach sklerotisiertes Chitin mit einem grünen Signal verbunden. Blaue Signale wurden zuvor als Regionen mit hohen Anteilen an Resilin oder verwandten Proteinen identifiziert.

Zur Identifizierung der Autofluoreszenz (Abb. 4) wurden fünf weitere Mägen und deren Bestandteile verwendet. Sie wurden zunächst mit Wasser gespült, auf Objektträgern angeordnet und mit Modelliermasse umgeben, um einen Kontakt zwischen Probe und Deckglas zu vermeiden. Glycerin (größer oder gleich 99,5 %, wasserfrei, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) wurde auf die Mägen aufgetragen, bis diese vollständig bedeckt waren. Abschließend wurde auf jede Probe ein Glasschlicker aufgebracht.

CLSM-Bilder der Komponenten der Magenmühle. Ein Farbvergleich ist nur innerhalb jedes einzelnen Bildes möglich, da diese einzeln aufgenommen wurden. (A) Medialer Zahn. (B) Seitenzahn. (C) Nebenzahn. (D) Basis des medialen Zahns und der Herzkammer. Der Pfeil zeigt in die vordere und hintere Richtung. (E). Setae mit starker Vergrößerung. (F) Herzklappe und umgebende Strukturen. (G) Setae und umgebende Membran. A anterior, AT akzessorischer Zahn, CC Herzkammer, CV Herzklappe, HI Scharnier des medialen Zahns, LT lateraler Zahn, MT medialer Zahn, P posterior, PrO präpterokardiales Gehörknöchelchen, PtO pterokardiales Gehörknöchelchen, ZO zygokardiales Gehörknöchelchen. Maßstabsbalken: A, 750 µm; B, 200 µm; C, 400 um; D, 750 µm; E, 20 µm; F, 1500 µm; G, 100 µm.

Die Mägen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM 700 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) nach dem Protokoll von49 sichtbar gemacht. Zur Visualisierung der Autofluoreszenz wurden vier stabile Festkörperlaser verwendet (Wellenlängen 405 nm, 488 nm, 555 nm und 639 nm). Um die emittierte Autofluoreszenz zu erfassen, verwendeten wir Bandpass- oder Langpass-Emissionsfilter, die Licht mit Wellenlängen von 420–480 nm, größer oder gleich 490 nm, größer oder gleich 560 nm und größer oder gleich 640 nm durchließen. Objektive mit × 5 (Zeiss Plan-Apochromat, numerische Apertur (NA) = 0,16), × 10 (Zeiss EC Plan-Neofluar, NA = 0,45) oder × 20 (Zeiss Plan-Apochromat, Luftimmersion, NA = 0,8) Vergrößerung angewendet wurden. Jedem Bild wurden die Farben Blau, Grün, Rot (50 % Sättigung) und Rot (50 % Sättigung) zugeordnet. Anschließend wurde die maximale Intensitätsprojektion unter Verwendung der Software Zeiss Efficient Navigation (Zen) (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH) berechnet.

Mittels EDX kann die lokale Elementzusammensetzung bestimmt werden. Die Nanoindentationstechnik ermöglicht die Identifizierung der lokalen mechanischen Eigenschaften Härte (H) und Elastizitätsmodul (E, Elastizität, Elastizitätsmodul). EDX- und Nanoindentationsanalysen wurden an denselben beiden zusätzlichen Magenmühlen durchgeführt. Da wir mit eingebetteten Proben arbeiteten (siehe unten), konnten wir diese beiden Tests immer an denselben Stellen durchführen – zuerst wurden EDX-Analysen durchgeführt und anschließend wurde dieselbe Stelle durch Nanoindentation getestet.

Wir haben die Epikutikula, die am Fehlen von Fasern zu erkennen ist, und die Exokutikula in den meisten Strukturen getestet. Wir haben die Endokutikel nicht untersucht, da die äußere Schicht (Epi-Plus-Exokutikel) eine enge Wechselwirkung mit der Nahrung hat und daher Anpassungen an trophische Präferenzen zeigen könnte. Die deutlich weichere Endokutikel hingegen trägt wahrscheinlich zur Funktion bei, indem sie Mikrorisse unterdrückt, wie frühere Studien an Krebstieren gezeigt haben50,51,52,53,54,55,56.

Mittels EDX und Nanoindentation konnten wir die Epi- und Exokutikula des akzessorischen Zahns, der Herz-Pylorus-Klappe, des lateralen Zahns, des lateralen Herzknöchelchens, des medialen Zahns, des Pterokardien-Ossikels und des Zygokardien-Ossikels an verschiedenen Stellen (für die Kutikula) testen Schichten, siehe ergänzende Abbildung 1). Aufgrund der Dünnheit der Membran und der Setae wurde nur die elementare Zusammensetzung untersucht, ohne klare Unterscheidung zwischen Epi- und Exocuticula. In der Membran war die Unterscheidung zwischen Epi- und Exocuticula eher schwierig; Infolgedessen könnte die „Membran-Epikutikula“ dieser Studie „Epikutikula und einige Schichten der Exokutikula“ sein. Für jede Seta konnten wir zwischen Basis und Spitze unterscheiden, sortierten die Ergebnisse jedoch nicht nach der Nagelhautschicht.

Die Mägen wurden mit doppelseitigem Klebeband an Objektträgern aus Glas (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) befestigt. Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur wurde jeder Magen von einem Metallring umgeben, der mit Epoxidharz (RECKLI EPOXI WST, RECKLI GmbH, Herne, Deutschland) gefüllt wurde und drei Tage lang bei Raumtemperatur polymerisierte (Der Elastizitätsmodul des polymerisierten Epoxidharzes beträgt 1,3). ± 0,3 GPa). Der Metallring sorgte dafür, dass die Probenoberfläche nahezu parallel zum Probenhalter verlief. Dieses spezielle Epoxidharz wurde ausgewählt, da es, wie aus früheren Studien39,40,41,42,43,57,58 bekannt ist, die Strukturen nicht infiltriert. Nach der Polymerisation wurden Objektträger und Klebeband entfernt und jede Probe mit Schleifpapier unterschiedlicher Rauheit poliert, bis die angestrebten Strukturen sichtbar waren. Anschließend wurde die Oberfläche auf einer Poliermaschine (Minitech 233/333, PRESI GmbH, Hagen, Deutschland) mit Aluminiumoxid-Polierpulversuspension der Körnung 0,3 µm (PRESI GmbH, Hagen, Deutschland) geglättet. Die Proben wurden fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad gereinigt, getrocknet und mit Platin sputterbeschichtet (5 nm Schicht). Mit dieser Methode erhielten wir Schnitte der Strukturen, die in den meisten Fällen die Prüfung der Epikutikula und Exokutikula ermöglichten.

Vor der Analyse einer Probe mittels EDX wurde der Detektor immer mit Kupfer (Cu) kalibriert. Da eine zusätzliche Kalibrierung mit H (Wasserstoff) nicht möglich war, sind unsere Ergebnisse semiquantitativ, dh die Ergebnisse zu den Anteilen leichterer Elemente sind nicht so zuverlässig wie die der schwereren Elemente. Für das semiquantitative EDX verwendeten wir das SEM Zeiss LEO 1525 (One Zeiss Drive, Thornwood, New York, USA), ausgestattet mit einem Octane Silicon Drift Detector (SDD) (Mikroanalysesystem TEAM, EDAX Inc., New Jersey, USA). ) [ein detailliertes Protokoll finden Sie unter 58,59,60,61,62]. Für alle Messungen haben wir eine Beschleunigungsspannung von 20 keV und die gleichen Einstellungen (z. B. Linsenöffnung, Arbeitsabstand usw.) verwendet. Wir haben kleinere Bereiche mit Größen von 4 × 3 µm (für Setae) bis 20 × 15 µm (für Epicuticula) getestet, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten (ergänzende Abbildung 1).

Aluminium (Al), Kohlenstoff (C), Calcium (Ca), Chlorid (Cl), Fluor (F), Wasserstoff (H), Eisen (Fe), Kalium (K), Magnesium (Mg), Natrium (Na), Sauerstoff (O), Phosphor (P), Platin (Pt), Schwefel (S), Silizium (Si) und Zink (Zn) wurden nachgewiesen und ihre Anteile gemessen. Für diese Studie haben wir die Daten des Atomverhältnisses (Atom-%) verwendet. Die Werte wurden mit zwei Nachkommastellen empfangen, aufgrund von Nachweisgrenzen jedoch auf eine Dezimalstelle gerundet. Auf die folgenden Elemente gehen wir nicht ein, da sie entweder die elementare Grundlage des Chitins (C, H, O), der Beschichtung (Pt) oder des Polierpulvers (Al, O) sind. Für einige Berechnungen wurden Ca, Cl, F, Fe, K, Mg, Na, P, S, Si und Zn als „alle Elemente“ (Ae) zusammengefasst.

Für die Nanoindentation [ein detailliertes Protokoll finden Sie unter 39,42,43,57,58,61] wird ein Nanoindenter SA2 (MTS Nano Instrument, Oak Ridge, Tennessee, USA) verwendet, der mit einer Berkovich-Indenterspitze und einem dynamischen Kontaktmodulkopf (DCM) ausgestattet ist war angestellt. Es wurde eine Poisson-Zahl von 0,3 verwendet. Härte (H) und Elastizitätsmodul (E) wurden aus Kraft-Abstands-Kurven mithilfe der kontinuierlichen Steifigkeitsmesstechnik63 bestimmt. Alle Tests wurden unter normalen Raumbedingungen (relative Luftfeuchtigkeit 28–30 %, Temperatur 22–24 °C) durchgeführt und jeder Eindruck und seine Kurve wurden manuell gesteuert. Die mechanischen Eigenschaften wurden bei einer Eindringtiefe von 480–520 nm bestimmt. Für jeden Ort erhielten wir 30 Werte, die gemittelt wurden, um einen Mittelwert pro Einzug zu erhalten. Nach dem Testen der Zielregion wurden die Proben poliert, bis die nächste interessierende Region sichtbar war.

Alle Schritte des Protokolls (EDX und Nanoindentation) wurden wiederholt, bis alle Orte getestet wurden (für Orte siehe ergänzende Abbildungen 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13). Insgesamt wurden 221 Lokalisationen in zwei Mägen untersucht.

Statistische Analysen wurden mit JMP Pro, Version 14 (SAS Institute Inc., Cary, North Caroline, 1989–2007) durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden berechnet und Shapiro-Wilk-W-Tests zur Prüfung der Normalität durchgeführt. Bei normalverteilten Daten wurden t-Tests durchgeführt; Bei nicht normalverteilten Ergebnissen wurden Chi-Quadrat-Tests und anschließend ein paarweiser Vergleich mit der Wilcoxon-Methode durchgeführt. Korrelationskoeffizienten wurden auch mit der JMP-Software berechnet.

Lichtmikroskopische Bilder siehe Abb. 1; für REM-Bilder siehe Abb. 2, 3.

Der mediale Zahn besitzt einen markanten hinteren Fortsatz, der zwei abgerundete Vorsprünge trägt, die nach lateral zeigen (Anweisungen siehe Abb. 1). Unterhalb dieses Processus verlaufen mehrere kleinere Vorsprünge von medial nach lateral. Vorne finden sich zwei rundliche und markante Platten mit scharfen Kanten. Der mediale Zahn interagiert über ein dünnes Scharnier mit dem breiten und dicken vorderen Gehörknöchelchen. Das Gehörknöchelchen des Pterokardias ist anterior mit dem dünnen Gehörknöchelchen des Präpterokardiens verschmolzen, das mit der dünnen Herzkammer verschmilzt. Jeder Seitenzahn trägt drei rundliche und große vordere Höcker und einen kleineren ventralen Höcker. Man findet zehn Grate, deren Dicke nach hinten hin abnimmt. An der Außenseite jedes Seitenzahns befindet sich ein zusätzlicher Höcker. Die Basen dieser Zähne gehen in das Jochbeinknöchelchen über, das über ein nach lateral gerichtetes Gelenk mit dem Pterokardialknöchelchen zusammenwirkt. Der Nebenzahn enthält ein hervorstehendes Dentikel und drei kleinere Vorsprünge. Anterior interagiert der Nebenzahn mit dem dünnen, spangenartigen Gehörknöchelchen und posterior mit dem dickeren lateralen Herzknöchelchen. Die Gehörknöchelchen des Pectineums scheinen zusammen mit den Gehörknöchelchen des Zygokardias, den Gehörknöchelchen des Pterokardias und den Gehörknöchelchen des Herzens als Stabilisatoren zu fungieren und zu verhindern, dass der Magen während der Nahrungsaufnahme kollabiert.

Zwischen den Gehörknöchelchen ist die Kutikula häutig, weicher und dicht mit Borsten besetzt (Abb. 3). Je nach Fundort weisen Setae unterschiedliche Morphologien des Schafts auf, wohingegen ihre Befestigung an der Membran eine ähnliche Morphologie zu haben scheint; Wir konnten keine Höhlen identifizieren, sondern einen eher direkten Übergang von der Membran zur Borstenbasis. In Fundort 1 ist die Hälfte des Seta-Schafts (die Basis) frei von Setulas oder Zähnchen; nur die Spitzen tragen kleine Vorsprünge (Abb. 3A–D). Fundort 3 ist mit Setae mit längeren Vorsprüngen bedeckt. Fundort 2 ist mit langen Haarborsten bedeckt, die lange gezackte Borsten (plumodenticulierte Borsten) tragen, die agglomeriert sind und ein Netz zu bilden scheinen (Abb. 3E–I). Die Standorte 4 und 5 tragen lange Borsten ohne Borsten oder Zähnchen, die sich zusammenballen und Matten bilden (Abb. 3J–L).

Die voluminöse Herzkammer geht hinten in die kleine Pyloruskammer über; Beide Kammern sind durch die Herzklappen verbunden. Die Pyloruskammer wird durch die Pylorusknöchelchen und die unteren Ampullenknöchelchen stabilisiert; seine innere Membran ist mit Setae bedeckt (Standorte 6 und 7). Fundort 6 trägt lange Seten, die mit kleinen Schuppen bedeckt sind (möglicherweise pappose Setae; Abb. 3M–N), und Fundort 7 Setae, die denen von Fundort 3 ähneln (Abb. 3O). Da der Magen zusammen mit dem Panzer gehäutet wird, konnten bei einigen Exemplaren unreife Strukturen unterhalb der Kutikula gefunden werden (Abb. 2O).

Auch ohne Schädigung der Zähne traten tiefe Risse in der Epi- und Exokutikula, die entlang der Fasern verliefen, als Artefakt der Trocknung bei Raumtemperatur auf (Abb. 2). Dies deutet bereits darauf hin, dass Zähne nicht homogen sind, sondern aus Schichten mit unterschiedlichen Materialeigenschaften bestehen.

Die Epikutikula konnte durch das Fehlen von Chitinfasern identifiziert werden (Abb. 2), im Gegensatz zur Exokutikula, die aus Fasern besteht. Zwischen diesen Fasern konnten größere Ansammlungen von Partikeln (Größe ~ 0,3–0,6 µm) in den Zähnen und Gehörknöchelchen festgestellt werden (Abb. 2N). Es handelt sich wahrscheinlich um Bruchartefakte, könnten aber möglicherweise auch als Kristalle interpretiert werden. Hinsichtlich der Faserorientierung sind die Strukturen heterogen: In der Membran des Herzbeutels verlaufen die Fasern parallel zur Oberfläche. In den Gehörknöchelchen und Zähnen verlaufen sie jedoch senkrecht zu den Außenkanten und ändern dann ihre Ausrichtung eher zentral (Abb. 2C, E, M). Dabei verlaufen die Faserbündel parallel zur Membran und bilden sauber gestapelte Schichten. Jede Schicht ändert leicht ihre Ausrichtung (Abb. 2K), was zu einer allgemeinen helikoidalen Struktur führt (Abb. 2I, J).

Bei der Untersuchung des Magens in einem CLSM-Scan zeigten die medialen Zähne eine so starke Autofluoreszenz, dass wir nach Anpassung der Einstellungen keine Signale von anderen Strukturen erkennen konnten.

Wenn jede Struktur einzeln untersucht wurde, konnten Heterogenitäten innerhalb der Strukturen sichtbar gemacht werden. Der mediale Zahn (der prominente hintere Fortsatz, seine Vorsprünge und die beiden rundlichen Platten) emittierte eine starke grüne Autofluoreszenz (Abb. 4A). Die seitlichen Ränder des hinteren Fortsatzes und die Bereiche anteromedial der Platten erschienen eher rot. Die übrigen Bereiche emittierten eine blaue Autofluoreszenz. Beim Seitenzahn zeigten die vorderen drei Höcker ein so starkes Autofluoreszenzsignal, dass die übrigen Bereiche nicht sichtbar waren (Abb. 4B). Ein dünner Bereich, der die Basis der vorderen Zahnhöcker umgibt, erschien blau, wohingegen die meisten seitlichen Zahnhöcker grün erschienen. Die Spitzen der drei vorderen Höcker waren rot. Im akzessorischen Zahn (Abb. 4C) emittierte der prominente Dentikel ein grünes und die Basis und die Vorsprünge ein blaues Autofluoreszenzsignal. Die Herz- und Pyloruskammern waren im Allgemeinen blau ohne deutliche Farbverläufe (Abb. 4D, F). Das Scharnier zwischen der Herzkammer und dem Gehörknöchelchen des Pterokardias zeigte ein intensiveres blaues Signal. Bei starker Vergrößerung erschien die Membran, in die die Haarborsten eingebettet waren, blau; Die Borstenspitzen gaben ein rotes und die Basen ein grünes Signal ab (Abb. 4E). Wenn mehr von der umgebenden Membran in den einzelnen Scan einbezogen wurde, erschienen die Borsten jedoch grün (Abb. 4G). Dies zeigt, dass die Membran im Allgemeinen eine recht heterogene Materialzusammensetzung aufwies.

Für die Magenmühle entsprachen die Werte von H den Werten von E (Korrelationskoeffizient von 0,99; siehe Ergänzungstabelle 3).

Unsere E-Werte reichten von 20 GPa, gemessen z. B. in der Exokutikula des Jochbeinknöchelchens, bis zu 60 GPa, ermittelt für die Epikutikula der lateralen Zahnhöcker, der medialen Zahnschneidplatten und Vorsprünge (siehe Abb. 5, 6 und). Tabelle 1).

Härte und Elastizitätsmodul (beide in GPa) der verschiedenen getesteten Strukturen und Regionen werden angezeigt (genaue Werte finden Sie in den Tabellen 1, 2 und der Ergänzungstabelle 1). Oben – links: mechanische Eigenschaften von Epicuticula und Exocuticula (Daten für alle getesteten Strukturen werden zusammengefasst). Oben – rechts: Die mechanischen Eigenschaften von Epicuticula und Exocuticula werden für AT, CV, LcO, LT, MT, PtO und ZO zusammengefasst. Unten: mechanische Eigenschaften von Epicuticula und Exocuticula, getrennt dargestellt für jede getestete Struktur (AT, CV, LT, MT, PtO, LcO und ZO). AT akzessorischer Zahn, CV Herzklappe, EP Epicuticula, EX Exocuticula, LcO laterales Herzknöchelchen, LT lateraler Zahn, MT medialer Zahn, M Membran, PtO Pterokardiales Gehörknöchelchen, S Setae, ZO Zygokardiales Gehörknöchelchen.

Linke Seite: Verteilung aller Elemente (Ae), die nicht die Grundlage von Chitin sind, in der Epikutikula (oben) und der Exokutikula (unten). Rechte Seite: Elastizitätsmodul der Epikutikula (oben) und der Exokutikula (unten). Für die Materialeigenschaftsgradienten verwendeten wir die Mittelwerte der getesteten Standorte und rundeten sie entweder auf 0 %, 10 %, 20 %, 30 % und 40 % für die Elementzusammensetzung und auf 20 GPa, 30 GPa, 40 GPa, 50 GPa und 60 GPa für den Elastizitätsmodul. Der kleinste Wert (0 % und 20 GPa) wurde der Farbe Dunkelblau und der höchste Wert (40 % und 60 GPa) der Farbe Rot zugeordnet. Diese Farben wurden dann den getesteten Orten zugewiesen, indem in Illustrator Bereiche erstellt wurden, die mit dem Illustrator-Verlaufswerkzeug eingefärbt wurden.

Die Unterschiede zwischen Epicuticula und Exocuticula waren sowohl für H als auch für E hochsignifikant (siehe Tabelle 2). Die Epikutikula war in den meisten Strukturen härter und steifer als die Exokutikula (siehe Abb. 5, 6 und Ergänzungstabelle 1). Lediglich bei der Kardiopylorusklappe waren Epi- und Exocuticula in ihren mechanischen Eigenschaften recht ähnlich (siehe Abb. 5, 6 und Ergänzungstabelle 1). Die einzelnen Strukturen unterschieden sich deutlich in den H- und E-Werten (Ergänzungstabelle 2). Die härteste und steifste Struktur war der mediale Zahn, gefolgt von lateralem Zahn, akzessorischem Zahn, lateralem Herzknöchelchen, pterokardialem Gehörknöchelchen, Kardiopylorklappe und schließlich dem zygokardialen Gehörknöchelchen mit den niedrigsten Werten in H und E (siehe Abb. 5 und Ergänzungstabelle 1). ).

Beim Sortieren der H- und E-Werte nach den verschiedenen getesteten Lokalitäten wurden die höchsten Werte für den (Epicuticula des) medialen Zahns gemessen – an seinen Vorsprüngen, Platten und dem lateralen Teil des Griffels; und für den (Epicuticula des) Seitenzahns – an seinen hinteren Kämmen (Abb. 6B und ergänzende Abb. 13). Von diesen Orten an wurden die Strukturen allmählich weicher und flexibler. Die darunter liegende Exokutikula war an allen Stellen weicher und flexibler, aber nicht homogen (Abb. 6D und ergänzende Abb. 13). Der hintere Processus und die laterale Kante des medialen Zahns zeigten erneut die höchsten H- und E-Werte, zusammen mit den hinteren Leisten des lateralen Zahns. Gradienten, die für die Epikutikula festgestellt werden konnten, waren auch in der Exokutikula ausgeprägt.

Die Elementanteile (Atomverhältnis, Atom-%) von Ca, Cl, F, Fe, K, Mg, Na, P, S, Si und Zn wurden gemessen und analysiert (zusammengefasst zu „alle Elemente, Ae“). Hinsichtlich Ae, F und Si konnten wir hochsignifikante Unterschiede und für Ca und Na signifikante Unterschiede zwischen Epi- und Exokutikula feststellen (Werte aller Strukturen zusammengefasst) (siehe Tabelle 2). Die Anteile von Cl, Fe, K, Mg, P, S und Zn unterschieden sich nicht signifikant zwischen Epi- und Exocuticula. Im Allgemeinen fanden wir höhere Anteile an Elementen in der Epikutikula (siehe Abb. 6, 7 und Tabelle 2): Der Gehalt an Ae, Ca, F und Si war besonders höher und an Cl, Fe, K, Mg, Na und P in der Epikutikula etwas höher. Die S- und Zn-Gehalte waren sowohl in der Epikutikula als auch in der Exokutikula ähnlich.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse (EDX) der Epikutikula und Exokutikula (alle untersuchten Strukturen werden zusammengefasst) (genaue Werte siehe Tabelle 2). Die Elementanteile von Ae, Ca, Cl, F, Fe, K, Mg, Na, P, S, Si und Zn werden in Atom-% angegeben. Ae alle Elemente, EP Epicuticula, EX Exocuticula.

In Bezug auf die einzelnen analysierten Strukturen (Werte von Epicuticula und Exocuticula zusammengefasst) stellten wir fest, dass sich die meisten Strukturen hinsichtlich des Ae-, Ca-, Cl-, F-, Fe-, Mg-, P-, S-, Si- und Zn-Gehalts stark unterschieden (Ergänzung). Tabelle 2). Die meisten Strukturen zeigten keine Unterschiede in den K- und Na-Anteilen. Für Ae (alle Elemente) und viele einzelne Elemente (Ca, Cl, P, Si) enthielten die Zähne die höchsten Anteile. Bei einigen Elementen (F, Fe, Mg, S) war dies jedoch nicht der Fall, was das Bild eher rätselhaft macht (siehe Tabelle 3, Ergänzende Abbildungen 2, 3, 4, 5, Ergänzende Tabelle 1).

Bei der Sortierung der Daten nach den Elementverhältnissen zu den Strukturen und der Kutikulaschicht (Tabelle 1 und ergänzende Abbildungen 4, 5) enthielt die Epikutikula in den meisten Fällen mehr Elemente als die Exokutikula. In der Membran hingegen waren die Gehalte fast aller Elemente sowohl in der Epikutikula als auch in der Exokutikula ähnlich. So stellten wir bei den meisten Strukturen fest, dass sich Epi- und Exocuticula in ihren Materialeigenschaften unterscheiden, wohingegen die Membran hinsichtlich der Elementverteilung homogener zu sein schien.

Bei der Sortierung der Elementanteile nach den verschiedenen Lokalitäten (Ergänzende Abbildungen 7, 8, 9, 10, 11, 12) wurden die höchsten Werte von Ae (ähnlich den H- und E-Werten) für das (Epikutikula) Medial ermittelt Zahn – an seinen Vorsprüngen, Platten und dem seitlichen Teil des Stifts; und für den (Epicuticula des) Seitenzahns – an seinen hinteren Leisten und vorderen Höckern (Abb. 6A). Von diesen Fundorten an wurden die Strukturen weniger mineralisiert. Die darunter liegende Exokutikula war an allen Stellen weniger mineralisiert, aber nicht vollständig homogen (Abb. 6C). Der hintere Processus und die Seitenkanten des medialen Zahns besaßen wiederum die höchsten Elementproportionen. Gradienten, die für die Epikutikula ermittelt werden konnten, konnten auch in der Exokutikula gefunden werden, waren jedoch nicht so ausgeprägt. Si wurde in hohen Anteilen im (Epicuticula des) medialen Zahns gefunden – an seinen Vorsprüngen und Platten; im (Epicuticula des) Seitenzahns – an seinen Höckern und Leisten; und im (Epicuticula des) Nebenzahns – an seiner Spitze. Im Allgemeinen wurden Si-Einlagerungen an den Oberflächen der Zähne festgestellt, die mit der Nahrung interagieren. Bei den Setae enthielten die Spitzen immer mehr Ae und Ca als die Basen (Ergänzende Abbildung 12).

Die meisten Parameter korrelierten positiv (siehe Ergänzungstabellen 3, 4, 5, 6). E und H zeigten eine sehr hohe positive Korrelation (r = 0,99); Ae und Ca, Ae und H, Ae und P, Ae und Si, Ae und E, Ca und Cl, Ca und A, H und Si, Si und E – hohe positive Korrelationen (r = 0,75–0,87). Ae und Cl, Ae und Cl, Ae und F, Ae und Fe, Ae und Zn, Ca und F, Ca und Fe, Ca und Zn, Cl und F, Cl und P, F und Mg, F und P, F und Zn, Fe und Zn, K und P zeigten mäßig positive Korrelationen (r = 0,50–0,69). Alle anderen Parameterpaare zeigten geringe oder vernachlässigbare Korrelationen.

Bei der Auftragung des Elastizitätsmoduls gegen den Anteil der Elemente wird der positive Zusammenhang sichtbar (zwischen E und Ae, E und Si, E und Ca, E und F, E und P) (ergänzende Abbildung 6). Wenn diese Werte jedoch entweder nach Epi- oder Exokutikula sortiert werden, konnten wir feststellen, dass dieser Zusammenhang für die Epikutikula besonders ausgeprägt ist, während wir einen solchen Zusammenhang für die Exokutikula nicht feststellen konnten (Abb. 8).

Beziehung zwischen dem Elastizitätsmodul, angegeben in GPa, und den Anteilen, angegeben in Atom-%, jedes einzelnen Elements und Ae für die Epikutikula (oben) und die Exokutikula (unten). Ae alle Elemente, EP Epicuticula, EX Exocuticula.

Die Krustentier-Epikutikula scheint zwischen den Taxa unterschiedlich zu sein [für eine umfassende Übersicht siehe 65]. Ihm fehlen Chitinfasern und es wurde festgestellt, dass er hauptsächlich aus Wachsen mit einigen Ansammlungen von Kalziumsalzen besteht [zum Panzer siehe 66,67,68; für Mandibeln siehe 69]. In einigen früheren Studien wurde jedoch ein hoher Gehalt an Si70,71,72,73,74 und Ca75 in den Unterkiefern festgestellt. Für die Magenmühle wurde bisher nur Si in großen Mengen in den Zähnen bestimmt15,16, das hier für die Epikutikula der Zähne nachgewiesen wurde (5–18 Atom-%). Unsere Werte liegen innerhalb der Si-Bereiche, die durch frühere Studien an den Mandibeln von Copepoda ermittelt wurden (bis zu 29 % Si72,74). Dies verdeutlicht, dass die Epikutikula offenbar stark an die Umgebung und ihre spezifische Funktion angepasst ist69, z. B. die Bildung einer osmiophilen Wachsschicht, die den Wasserverlust bei terrestrischen Arten reduziert76,77, oder einer dicken Schicht in den Mandibeln oder Magenmühlenzähnen, die unterstützend wirken das Schneiden und Zerkleinern von Lebensmitteln78,79.

Zuvor wurde festgestellt, dass die Exokutikula von Crustacea gestapelte Schichten aus Chitin-Protein-Fibrillen mit unterschiedlicher Ausrichtung (Bouligand- oder gedrehte Sperrholzstrukturen) enthält [für Panzer siehe 67; für Extremitäten siehe 53,55,56,80,81,82,83; für Panzer und Extremitäten siehe 50]. Diese spezielle Anordnung machte die Exokutikula zu einem leichten Material von enorm hoher Festigkeit und Zähigkeit mit Rissablenkung und Neuausrichtung [für eine umfassende Übersicht über Zähigkeitsmechanismen siehe 84]. Hier wurde eine ähnliche Mikrostruktur für die Exokutikula der Zähne und Gehörknöchelchen der Magenmühle beobachtet.

Frühere Studien ergaben, dass sich Calciumcarbonat und Calciumphosphat zwischen den Fasern der Krustentier-Exokutikula befinden, wodurch die Strukturen gestärkt und die chemische Beständigkeit erhöht werden [zur Magenmühle siehe 15; zum Panzer siehe 67,68,85; für Panzer und Extremitäten siehe 50,52,86; für Mandibeln siehe 69,72,73,75,78,87; für Extremitäten siehe 81,88]. Auch Cl wurde bereits früher nachgewiesen [in der Magenmühle, siehe16; in Mandibeln, siehe72,73]. Hier haben wir Ca, P, Cl und F sowohl im Epi- als auch im Exocuticula identifiziert, was darauf hindeutet, dass möglicherweise Apatit (Chlor- und Fluorapatit) in die Magenmühle von Procambarus clarkii eingebaut ist. Apatit wurde zuvor auch für die Magenmühlenzähne derselben Art13 und in der Kutikula anderer Krebstiere75,81,83,89,90 identifiziert.

Neben Ca, Cl und P wurden in der Kutikula von Krebstieren bisher folgende Elemente nachgewiesen, die nicht die Grundlage von Chitin bilden und vermutlich die Kutikula verstärken: Mg50,51,55,69,78,81,88; S, K, Br, Zn, Cu, Fe und Ni in Copepoden-Mandibeln72; Cu und Zn in Copepoden-Mandibeln71; Br in Amphipoden-Mandibeln73 und Asseln-Klauen88; S in Garnelenscheren52. Für Procambarus clarkii haben wir auch Mg, K, S, Zn und Fe, aber kein Br, Ni und Cu nachgewiesen. Darüber hinaus haben wir Na entdeckt, das unseres Wissens bisher nicht in der Kutikula von Krustentieren gefunden wurde.

Bei Napfschnecken-Radularzähnen, die ebenfalls aus Chitinfasern bestehen, wurde zuvor festgestellt, dass Mg und Ca an der Proteinpackung beteiligt sind, was mit einer Erhöhung der Chitinfaserdichte und der Materialsteifigkeit zusammenhängt91. Möglicherweise sind hier auch Mg und Ca an der Versteifung des Chitins in Krebstieren beteiligt, was jedoch weiteren Untersuchungen bedarf. Es wurde zuvor festgestellt, dass Na, K und S mit der Proteinbindung und dem Bräunungsgrad in Zusammenhang stehen können [z. B. 92, 93, 94] – möglicherweise ist dies auch bei Krebstieren der Fall. Die nachgewiesenen Anteile von Fe und Zn erhöhen möglicherweise auch die Steifheit und Härte in der Magenmühle, vergleichbar mit Molluskenzähnen – obwohl die nachgewiesenen Anteile im Vergleich zu den Einbauten in Polyplacophora und Napfschnecken sehr gering sind [z. B. 58,60,95 ,96]. Aber auch hier bedarf es weiterer Untersuchungen.

Die Härte (H) ist das Maß für den Widerstand gegen lokale plastische Verformung durch Einkerbung oder Abrieb. Der Elastizitätsmodul (E) gibt die Steifigkeit eines festen Materials an und beschreibt den Zusammenhang zwischen Zugspannung und axialer Dehnung. Sie korreliert mit der Fähigkeit des Materials, Kraft zu übertragen, was wichtig ist, um das Durchstoßverhalten und die Bruchfestigkeit zu verstehen [für eine umfassende Übersicht über die Durchstoßmechanik siehe 64].

In Bezug auf die mechanischen Eigenschaften wurden in früheren Studien an verschiedenen Krebstier-Taxa die folgenden Elastizitätsmodule ermittelt: Für Daktylen liegen die Werte zwischen 25 und 60 GPa83 und zwischen 10 und 70 GPa81; für Krallen 2 bis 26 GPa52 und 5 bis 32 GPa88; für Mandibeln 4 bis 33 GPa69 und 10 bis 100 GPa75; für Chelae von 2 bis 55 GPa51; für die Exokutikula von Panzern 8 bis 24 GPa56 und 8 bis 69 GPa50. Die meisten dieser Studien zeigten, dass die Werte von der interagierenden Oberfläche zum Inneren hin abnehmen, was auch für die Magenmühle von Procambarus clarkii zu beobachten war. Die hier erhaltenen E- und H-Werte, insbesondere der Epikutikula der Kauoberflächen (dh Platten, Vorsprünge, Höcker, Leisten) der medialen und lateralen Zähne sind hoch, liegen jedoch innerhalb des für Daktylen, Mandibeln, Chela und Panzer gemessenen Bereichs .

Funktionelle Gradienten und Heterogenitäten können ihren Ursprung in der Geometrie, Zusammensetzung und Struktur haben [Übersichten siehe 36,84]. In Krustentier-Exoskeletten sind die chemische Zusammensetzung (d. h. der Grad der Mineralisierung75), die Dimension der Faserschichten (d. h. die zunehmende Schichtdicke von der Exokutikula zur Endocuticula53,80,86), die Ausrichtung der Fibrillen (d. h. die periodisch helikale Anordnung54, 80,86) oder eine Kombination aus chemischen und strukturellen Gradienten mit abgestuften Grenzflächen81,82,90 wurde zuvor festgestellt, dass sie lokale Heterogenitäten verursachen, die die Funktion der Struktur bestimmen [zur Übersicht siehe 65]. Darüber hinaus trägt wahrscheinlich auch die lokale Dicke der Epikutikula zur Funktion bei, z. B. zu ihrer Abriebfestigkeit. Für die Magenmühlenstrukturen der Seespinne (Brachyura, Decapoda)97 wurde bereits eine große Dickenschwankung festgestellt, die in künftigen Studien im Mittelpunkt stehen sollte.

Für die Magenmühle von Procambarus clarkii haben wir, wie auch in früheren Studien an der Kutikula von Krustentieren [z. B. 50,51,55,56,65,83], festgestellt, dass sich die Härte- und Elastizitätswerte auf den Mineralstoffgehalt beziehen. Diese Beziehung ist in der Epikutikula besonders ausgeprägt; hier scheinen die mechanischen Eigenschaften ihren Ursprung in den Anteilen und der Verteilung der folgenden anorganischen Elemente zu haben: Si (möglicherweise als Siliciumdioxid gebunden), Ca, P und F (möglicherweise als Apatit vorhanden).

In der Exokutikula scheinen die mechanischen Eigenschaften jedoch ihren Ursprung im Bräunungsgrad zu haben, da der Mineralstoffgehalt nicht vollständig mit den gemessenen mechanischen Eigenschaften zusammenhängt. In früheren Studien zur Kutikula von Arthropoden [z. B. 98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112] ermöglichte die Laseranregung über CLSM die Identifizierung von Regionen mit der folgenden dominierenden Materialzusammensetzung gemäß dem Protokoll von49: (a) sklerotisierte, steife Kutikula war mit einem roten Signal verbunden; (b) schwach sklerotisiertes Chitin mit grünem Signal. Manchmal erschienen diese Bereiche in Kombination mit dem elastischen und flexiblen Protein Resilin [zur Übersicht siehe 101] in der Überlagerung braun, gelb oder rosa, da Resilin ein blaues Signal erzeugt. (c) Blaue Signale wurden als Regionen identifiziert, die hohe Anteile an Resilin oder verwandten Proteinen enthalten. Diese Studien wurden an Flügeln106, Fußbefestigungsgeräten und Beinen107,108,109, Mundwerkzeugen38,110 oder Genitalien111,112 durchgeführt. Die vorgeschlagene Beziehung zwischen dem emittierten Autofluoreszenzsignal, das durch Befolgen des Protokolls49 empfangen wurde, und den mechanischen Eigenschaften wurde zuvor durch AFM-Nanoindentation für die Haare von Fußbefestigungsvorrichtungen bei einem Marienkäfer kreuzvalidiert107.

Bei Krebstieren wurde dieses CLSM-Protokoll zuvor auf die Mandibeln von Copepoden angewendet113,114 und zeigte Bereiche mit hoher Sklerotisierung (rotes Signal), hohem Resilingehalt (blaues Signal) und Si (grünes Signal) – es wurde jedoch noch nie zuvor bei Krebstieren kreuzvalidiert . Für die Magenmühlenkomponenten von Procambarus clarkii können wir hier die Autofluoreszenzsignale mit dem Elementgehalt und den mechanischen Eigenschaften in Beziehung setzen: Das starke grüne Signal in den Kauflächen der Zähne scheint mit dem Si-Gehalt in Zusammenhang zu stehen, ähnlich wie bei Copepoden-Mandibeln. Diese Strukturen sind die härtesten und steifsten Elemente. Die umgebenden Bereiche der blauen Autofluoreszenz sind weicher und flexibler, was wahrscheinlich auf weniger sklerotisiertes Chitin mit höherem Protein-/Resilingehalt zurückzuführen ist. Diese Region könnte möglicherweise als Stoßdämpfer bei der Interaktion mit einem harten Hindernis dienen, ähnlich wie bei den Ruderfußkrebsen113,114.

In den Setae konnten wir durch CLSM und EDX regionale Heterogenitäten identifizieren. Die Basis zeigte ein grünes Signal und die Spitze hingegen ein rotes Signal, was darauf hindeutet, dass die Basis wahrscheinlich weniger sklerotisiert und damit weicher ist als die Spitze – die jedoch einer Kreuzvalidierung mittels Nanoindentation mittels AFM harrt.

Als härteste und steifste Region wurden hier im Allgemeinen die Kauflächen des Magenfräsers (also die Epikutikula der Zahnhöcker) ermittelt. Diese hohe Härte verringert wahrscheinlich den Abrieb und die hohe Steifigkeit die Wahrscheinlichkeit eines Strukturversagens beim Zerkleinern und Zerkleinern [siehe9,11,12,26,45,114,116]. Die steifen und harten Gehörknöchelchen stabilisieren wahrscheinlich den Magen während dieser Vorgänge, während die Herzklappen verhindern, dass die Nahrungspartikel aus dem Darm in den Magen zurückkehren26,45.

Die Setae aus verschiedenen Magenregionen von Procambarus clarkii unterscheiden sich in ihrer Morphologie, ähnlich der zuvor beschriebenen Magenmühle von Majidae und Tanaidacea45,117. Wie für verschiedene Arten vorgeschlagen, sind die spitz zulaufenden Borsten von P. clarkii möglicherweise in der Lage, Partikel zu greifen [siehe 118,119,120,121], wohingegen die plumodentikulären Borsten diese wahrscheinlich filtern [siehe 118,121]. Die Pappose-Setae könnten als Chemorezeptoren [siehe 118, 121], Lückendichter [siehe 118], Mechanorezeptoren [siehe 118] oder Schaber [siehe 122] fungieren. Da die Basen der Setae bei P. clarkii weniger sklerotisiert und daher weicher und flexibler als die Spitze zu sein scheinen, sind die Setae wahrscheinlich in der Lage, sich unter dem Magenflüssigkeitsfluss zu biegen und zu bewegen.

Die Daten sind in den Zusatzdateien verfügbar und die Rohdaten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Elke Woelken vom Institut für Zell- und Systembiologie der Tiere der Universität Hamburg für ihre Unterstützung bei der SEM- und EDX-Analyse. Für die konstruktiven Kommentare der anonymen Gutachter sind wir sehr dankbar.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Forschung erhielt keine spezifischen Zuschüsse von Förderstellen im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Abteilung für Verhaltensbiologie, Institut für Zell- und Systembiologie der Tiere, Universität Hamburg, Martin-Luther-King-Platz 3, 20146, Hamburg, Deutschland

Wencke Krings & Jan-Ole Brütt

Abteilung für Säugetierkunde und Paläoanthropologie, Leibniz-Institut zur Analyse des Biodiversitätswandels, Martin-Luther-King-Platz 3, 20146, Hamburg, Deutschland

Wencke Krings & Jan-Ole Brütt

Department of Functional Morphology and Biomechanics, Zoological Institute, Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel, Am Botanischen Garten 1-9, 24118, Kiel, Germany

Wencke Krings & Stanislav N. Gorb

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WK hat das Projekt initiiert und gemeinsam mit SNG die Studie konzipiert. JOB steuerte Lichtmikroskopie- und REM-Bilder bei. WK führte Nanoindentations- und EDX-Analysen durch. WK verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts, der von JOB und SG umgeschrieben und korrigiert wurde. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zur Veröffentlichung zu.

Korrespondenz mit Wencke Krings.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krings, W., Brütt, JO. & Gorb, SN Mechanische Eigenschaften, Sklerotisierungsgrad und elementare Zusammensetzung der Magenmühle im Roten Sumpfkrebs Procambarus clarkii (Decapoda, Crustacea). Sci Rep 12, 17799 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22724-w

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Eingegangen: 18. August 2022

Angenommen: 18. Oktober 2022

Veröffentlicht: 23. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22724-w

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Angewandte Physik A (2023)

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