Photonischer Kristall verstärkte Fluoreszenzemission und Blinkunterdrückung für die Biosensorik mit Einzelquantenpunktauflösung und digitaler Auflösung

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4647 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Während nanoskalige Quantenemitter wirksame Markierungen für die Messung biomolekularer Wechselwirkungen sind, sind ihre Einsatzmöglichkeiten für Anwendungen, die Einzelbeobachtungen erfordern, durch die Anforderungen an große numerische Aperturobjektive (NA), Fluoreszenzintermittenten und eine schlechte Photonensammeleffizienz aufgrund der omnidirektionalen Emission begrenzt. Hier berichten wir über eine fast 3000-fache Signalverstärkung, die durch multiplikative Effekte verstärkter Anregung, stark gerichteter Extraktion, Verbesserung der Quanteneffizienz und Unterdrückung des Blinkens durch eine Oberfläche eines photonischen Kristalls (PC) erreicht wird. Der Ansatz erreicht eine Empfindlichkeit gegenüber einem einzelnen Quantenpunkt (QD) mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis, selbst wenn eine Linse mit niedriger NA und ein kostengünstiger optischer Aufbau verwendet werden. Die Blinkunterdrückungsfähigkeit des PCs verbessert die Einschaltzeit der QDs von 15 % auf 85 % und verringert so die Signalunterbrechung. Wir haben einen Assay für krebsassoziierte miRNA-Biomarker mit Einzelmolekülauflösung, Einzelbasenmutationsselektivität und einer Nachweisgrenze von 10 Attomol entwickelt. Darüber hinaus beobachteten wir unterschiedliche Oberflächenbewegungsverläufe von QDs, wenn ihre Oberflächenbindungsstringenz durch die Änderung einer einzelnen Base in einer krebsspezifischen miRNA-Sequenz verändert wird.

Chemische und auf Nanopartikeln basierende Fluoreszenzreporter sind weit verbreitete Bestandteile der biowissenschaftlichen Forschung und der molekularen Diagnostik. Photonenerzeugende Tags ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung biologischer Analyten, indem sie den Reporter an ein Zielmolekül anbringen und anschließend mit einem Instrument detektieren, das Fluoreszenz anregt und gleichzeitig die Photonenemission in einem optischen Sensor sammelt. Kolloidale QDs bieten eine breite Palette nützlicher optischer Eigenschaften für digitale Assays mit Einzelmolekül-Auslesungen, darunter große Absorptionskoeffizienten (>107 M–1 cm–1), schmale und weitgehend einstellbare Emissionsbanden, hohe Photostabilität und hohe Quanteneffizienz. Die Verstärkung fluoreszierender Reporter durch lokal erhöhte elektromagnetische Feldintensitäten durch plasmonische Oberflächen und Nanostrukturen hat sich als wirksame Strategie zur Erzielung reduzierter Nachweisgrenzen in biomolekularen Tests1,2,3,4,5,6 erwiesen, insbesondere für Tests, die Aggregate vieler Fluorophore nachweisen , deren Emission kombiniert wird, um Signale zu ergeben, die über der Hintergrundfluoreszenz und dem Schrotrauschen von Fotodetektoren erkennbar sind7,8,9,10. Zu den gängigen Assay-Strategien gehören die Aggregation vieler Fluorophore (z. B. ein Microarray-Spot) oder die Nutzung enzymatischer Amplifikation zur Erzeugung großer Mengen fluoreszierender Reporter aus einem einzelnen Analyten.

In den letzten Jahren befassten sich zahlreiche Forschungsarbeiten mit dem Problem, die Anregung einzelner fluoreszierender Reporter zu verbessern, ihre Photonenemission effizient zu sammeln und Signale zu erzeugen, die es ermöglichen, sie in Gegenwart verschiedener Rauschquellen zu beobachten. Mit der Total-Internal-Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) kann beispielsweise eine Einzelfluoreszenzauflösung erreicht werden, indem teure Ölimmersionsobjektive mit hoher NA und elektronenvervielfachende ladungsgekoppelte Kameras (EM-CCD) verwendet werden, um eine über 30-fache Steigerung des Signal-zu-Signals zu erzielen -Rauschverhältnis11, 12. Plasmonische Nanostrukturen13,14,15,16,17,18 haben sich als erfolgreich für die lokale Verstärkung der Anregungsintensität des elektrischen Feldes mit einem Fluoreszenzverstärkungsfaktor von ~100 bis ~1000 erwiesen, obwohl viele plasmonische Strukturen unter einem hohen Nicht-Rauschverhältnis leiden. Strahlungszerfall aufgrund intrinsischer Verluste im Metall, Löschung und geringer Richtungsabhängigkeit der emittierten Photonen16. Darüber hinaus wird die Resonanzwellenlänge solcher Nanostrukturen durch die Größe, Form und das Material der Nanoresonatoren festgelegt. Frühe Ansätze zur Anregung fluoreszierender Reporter mit dielektrischen optischen Mikrokavitäten zeigen bescheidene Verbesserungen der Emissionsrate19,20,21. Eine Einschränkung dielektrischer Mikrokavitäten ist die Diskrepanz zwischen High-Q-Resonanzen der Kavität und der spektral breiten Emission von inhomogen verbreiterten Fluoreszenzemittern bei Raumtemperatur. Jüngste Berichte über die Verstärkung elektromagnetischer Felder mit plasmonisch-dielektrischen Hybrid-Nanospalten und dielektrischen Nanodrahtplatten22 befassten sich mit diesen Problemen und zeigten eine etwa 1000-fache Verstärkung, jedoch mit einer kleinen Anzahl stark lokalisierter Hotspots, die nur einen kleinen Bruchteil der Gesamtoberfläche spärlich einnehmen Bereich. Dennoch ist eine präzise Ausrichtung zwischen Fluoreszenzemittern und Hohlraummodi erforderlich, um solch hohe Verstärkungsfaktoren durch ausgefeilte Nanofabrikation zu erreichen. Um diese Probleme zu überwinden, verwendeten wir in unserer bisherigen Forschung einen mikroskopiebasierten Ansatz zur Fluoreszenzverstärkung einer PC-Oberfläche über größere Oberflächenbereiche. Von einer Cy-5-konjugierten Streptavidinschicht auf einem eindimensionalen PC23 wurde ein 60-facher Anstieg der Fluoreszenzintensität berichtet. Diese Verbesserung kann um das 360-fache verbessert werden, indem der PC-Leckmodus über einen Goldspiegelreflektor mit einem darunter liegenden Fabry-Perot-Hohlraum gekoppelt wird. Über eine 108-fache Fluoreszenzverstärkung für eine QD-Schicht wurde berichtet, indem die Fluoreszenzextraktion mit Leaky-Mode-Unterstützung aus einer zweidimensionalen PC-Oberfläche verwendet wurde25. In jüngerer Zeit haben Yan et al. demonstrierten einen Mehrfach-Heterostruktur-PC mit einem superbreiten Stoppband, um eine Breitband-Fluoreszenzverstärkung um das Hundertfache zu erreichen26, was eine komplizierte schichtweise Herstellung von selbstorganisierten 2D-kolloidalen Kristallmonoschichten erforderte. Zur Verstärkung der Fluoreszenz wurden auch dreidimensionale PC-Strukturen verwendet. Song et al. haben eine Ru-Farbstoffschicht auf 3D-Opal-PCs aufgeschleudert, die aus mehreren Schichten von PMMA-Kugeln bestehen, um eine etwa 320-fache Lumineszenzverstärkung mit Dual-Stopband-Konfigurationen zu erreichen27.

Während mehrere wichtige Klassen niedrig konzentrierter Krebsbiomarker (Proteine, zirkulierende Tumor-DNA, lange nichtkodierende RNA, Lipide und Metaboliten) derzeit Gegenstand intensiver Forschungsaktivitäten und klinischer Validierung sind, konzentrieren wir uns hier auf den Nachweis zirkulierender microRNA (miRNA, miR). Mit dem deutlichen Aufschwung der Flüssigbiopsie können miRNAs als vielversprechender klinischer Krebs-Biomarker dienen, wobei viele Studien die miRNA-Konzentration mit bestimmten Gesundheitszuständen wie einer bestimmten Krebsart oder einem metastatischen Zustand in Verbindung bringen28,29,30,31. Das Potenzial für die empfindliche und quantitative Bestimmung der Konzentration von miRNA-Biomarkern aus menschlichem Serum auf regelmäßiger Basis ist ein Schritt in Richtung Krebsfrüherkennung, Behandlungsüberwachung, Prognose und Vorhersage von Behandlungsergebnissen und unterstreicht die Notwendigkeit kostengünstiger und einfacher Hochleistungsanwendungen Untersuchungen32. Unsere und andere Bemühungen haben den Beweis erbracht, dass strategisch ausgewählte Konzentrationen zirkulierender miRNA-Biomarker mit klinischen Ergebnissen verknüpft sind. Durch die Sequenzierung des RNA-Gehalts von Plasma-Exosomen entdeckte unser Team beispielsweise zwei miRNAs, miR-375 und miR-1290, die in starkem Zusammenhang mit den klinischen Ergebnissen bei Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs zum Zeitpunkt der Entwicklung einer Kastrationsresistenz (mCRPC) stehen33. Der Nachweis von miRNA in sehr geringer Konzentration und mit Einzelbasenunterscheidung ohne Beteiligung der RNA-Sequenzierung (die hochentwickelte Ausrüstung, große Probenvolumina und eine aufwendige Probenverarbeitung erfordert) stellt einen wichtigen ungedeckten Bedarf in der aktuellen klinischen Praxis dar.

Leider ist das Standardprotokoll der Vollblut-RNA-Isolierung und -Reinigung, gefolgt von der Zielidentifizierung durch quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (qRT-PCR), arbeitsintensiv, erfordert eine enzymatische Amplifikation und kann unter Sequenzverzerrungen leiden34, 35. In der Praxis ist qRT-PCR Assays erfordern einzigartige Primer und Amplifikationsmethoden für kurze miRNA-Zielsequenzen, wodurch sie für die Analyse kleiner Volumina nicht geeignet sind36, während sequenzierungsbasierte Ansätze (RNA-Seq) eine aufwändige Probenverarbeitung, teure Ausrüstung, lange Wartezeiten und Bioinformatik-Expertise erfordern. All dies schränkt ihre Verwendung ein. Bei qRT-PCR37 wird eine hohe Empfindlichkeit durch enzymatische Amplifikation erreicht, die für die Genauigkeit sowohl eine Umwandlung in DNA (reverse Transkription) als auch eine vollständige enzymatische Amplifikation erfordert. Digitale Tröpfchenansätze haben die quantitative Analyse von Bioproben mit geringem Volumen erheblich verbessert. Allerdings schränken ähnliche Herausforderungen das Auslesen von qRT-PCR-Assays von miRNA im Tröpfchenformat ein, was durch den geringen Durchsatz der Tröpfchenpartitionierung, die Gerätekosten, den kleinen Dynamikbereich und komplexe Datenanalyseschritte noch verstärkt wird. Elektrochemische Sensoren sind in der Lage, ultraempfindliche (<1 pM)38 und amplifikationsfreie miR-Detektion mit einer einfachen Auslesung39,40,41 durchzuführen, haben jedoch einen eingeschränkten Betriebstemperaturbereich42. Dennoch ist die Entwicklung eines molekulardiagnostischen Tests erforderlich, der ultraempfindlich und hoch zielspezifisch ist, um Nukleinsäuren ähnlicher Sequenzen in niedrigen Konzentrationen effektiv zu unterscheiden. Darüber hinaus ist für den Point-of-Care-Einsatz ein diagnostischer Assay wünschenswert, der keine enzymatische Amplifikation erfordert. Die Entwicklung einer schnellen und kostengünstigen Diagnostik ist für die Verbreitung von Technologien für klinische Anwendungen in breiten Point-of-Care-Umgebungen von entscheidender Bedeutung43.

In dieser Arbeit stellen wir eine Sensorstrategie für den hochspezifischen Nachweis eines krebsspezifischen miRNA-Ziels vor, indem wir eine digitale Auflösung einzelner Moleküle mit einem optisch verbesserten hohen Signal-Rausch-Verhältnis ermöglichen. Insgesamt erreichen wir durch Qualitätsfaktortechnik eine etwa 3000-fache Steigerung der detektierten Photonenintensität einzelner QD-Tags (im Vergleich zur Detektion von QDs auf einer einfachen, unstrukturierten Glasoberfläche), wobei wir mithilfe experimenteller Charakterisierung, die durch elektromagnetische Simulationen unterstützt wird, einen 23-fachen Gewinn erzielen zu einer verbesserten Anregung, ein 39-facher Gewinn zu einer verbesserten Extraktion (einschließlich einer Verbesserung der Photonenextraktionsrate und einer Änderung der Quanteneffizienz über den Purcell-Effekt) und ein 3,5-facher Gewinn zu einer verbesserten Sammeleffizienz. Darüber hinaus verbessert die Blinkunterdrückungsfähigkeit des PCs die QDs auf Zeit von 15 % auf 85 % und bietet so eine Methode zur Verbesserung von Signalintermittentenproblemen, die bei ultraempfindlichen Messungen auftreten, und erleichtert gleichzeitig die schnelle Bewegungsverfolgung auf Einzelpartikelebene. Hier zeigen wir durch Ausnutzung dieser synergistischen Eigenschaften, dass das PC-QD-System eine Einzel-QD-Empfindlichkeit mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (~59) unter Verwendung einer Linse mit niedriger NA (NA = 0,5, 50×) ohne TIRF oder mit hoher Auflösung erreichen kann Gewinnen Sie eine Elektronenvervielfachungskamera. Unsere Erforschung physikalischer Prinzipien zur Verbesserung der Anregung, Extraktion, Emissionsrate und Sammeleffizienz einzelner QDs basiert auf unserem Wunsch, empfindlichere, quantitativere und einfachere Methoden zum Nachweis krebsbezogener Biomarker in klinischen Proben mit geringem Volumen zu entwickeln. Ein weiterer Aspekt dieser Studie ist die Nutzung der Single-QD-Bildgebungsfähigkeit für einen biomolekularen Assay mit digitaler Auflösung, der einen empfindlichen und selektiven Nachweis eines miRNA-Biomarkers ermöglicht hat, der für den Nachweis anderer miRNAs sowie DNAs und Proteine ​​angepasst werden kann. In diesem Bericht verwenden wir das PC-QD-System, um einen hochspezifischen zweistufigen miRNA-Assay bei Raumtemperatur aus einem Probenvolumen von 45 μl zu implementieren, um eine digitale Auflösung einzelner Zielmoleküle zu ermöglichen, was zu einer Nachweisgrenze von ~10 aM für eine einzelne Base führt -Paar-Mismatch-Selektivität und hoher Dynamikbereich (9 Größenordnungen). Interessanterweise ist unser Bildgebungssystem durch die Nutzung der Funktion zur Unterdrückung des Blinkens bei der Verfolgung einzelner Partikel in der Lage, die dynamische Flugbahn einzelner QDs aufzuzeichnen, wodurch wir einen einzelnen Basenunterschied in einem Ziel-miRNA-Molekül in 10 Minuten ohne Waschschritt unterscheiden können. Unsere Strategie für den einfachen, empfindlichen, quantitativen und geringen miRNA-Nachweis wird durch die klinischen Anforderungen an die Point-of-Care-Diagnose bestimmt. Um Nichtlinearitäten zu vermeiden, die mehrstufigen enzymatischen Amplifikationen innewohnen, verwenden wir eine optische Einzelendpunktdetektion mithilfe von QD-Tags und einer PC-Oberfläche, um die Bildgebung einzelner oberflächengebundener QDs mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu ermöglichen, wodurch miRNA direkt gezählt werden kann.

Unser aktuelles Ziel geht über frühere Berichte über die Verbesserung von Quantenpunkten (QD) durch PC-Oberflächen1 hinaus und besteht darin, eine neu gestaltete nanostrukturierte PC-Oberfläche zu konstruieren, die mit einer einfachen, kostengünstigen Herstellung als universelles makroskopisches Substrat für die Fluoreszenzmikroskopie von QD-Tags dienen kann Prozess und stark verbesserter Verstärkungsfaktor. Wie in Abb. 1a, b gezeigt, haben wir ein Instrument entwickelt, das die Intensität der QD-Emission um das 3000-fache steigern kann und so die Möglichkeit eröffnet, einzelne QDs mit Objektiven mit niedriger NA (NA = 0,5, 50×) abzubilden, ohne dass dies erforderlich ist eine Ölimmersionslinse mit hoher NA (normalerweise NA ~ 1,46) und ein hochentwickeltes TIRF-Instrument. Eine viel größere Verbesserung wird durch Strahlungstechnik erreicht, bei der zwei Qualitätsfaktoren der Strahlung (Qr) und der Nichtstrahlung (Absorption oder unvermeidlicher Verlust aufgrund von Herstellungsfehlern, Qnr) präzise aufeinander abgestimmt werden. Die Q-Anpassungsanforderungen (Qr = Qnr) müssen für zwei PC-Resonanzmodi (Pumpmodus und Fluoreszenzmodus) erfüllt sein, um den Verstärkungsfaktor in Richtung theoretischer Grenzen zu maximieren. Diese 3000-fache Verstärkung wird auch auf die Integration multiplikativer Verstärkungsfaktoren zurückgeführt, um eine umfassende Verstärkung vom Fluoreszenzerzeugungsprozess (Absorption, Lebensdauer des angeregten Zustands, strahlende Fluoreszenzemission) bis zum Sammelprozess (Fernfeldverteilung und Blinkreduzierung) zu ermöglichen ), nachdem die Emissionsphotonen erzeugt wurden.

ein Schema des Brückenassay-Designs und des PC-QD-resonanzverstärkten miR-Digitalzählungsdetektionsansatzes unter Verwendung einer 3000-fachen Fluoreszenzverstärkung mit feiner Z-Schnittierung und Blinkunterdrückung. Im oberen Teil sind Komponenten der PC-QD-gestützten miRNA-Digitaldiagnostik dargestellt, wobei die ssDNA-Sonde (blau) auf einer QD-Streptavidin-Oberfläche mit einem Verhältnis von ~10:1 funktionalisiert ist. Basierend auf der NUPACK-Simulation ist die Länge des Einfangstrangs (gelb) auf 10 Basen (Paar mit dem unteren Teil des Ziels) eingestellt, während die Sondenlänge insgesamt 12 Basen (Paar mit dem oberen Teil des Ziels) beträgt von 22 Basen komplementärer Paare für die Doppelhybridisierung mit der Ziel-miRNA 375 (rosa). Beim brückenaktivierten Assay-Prozess werden QD-Tags auf die PC-Oberfläche gezogen, wenn Ziel-miRNAs einen oberflächengebundenen Komplex bilden. b An der Oberfläche erfasste QDs erfahren eine 3000-fache Verbesserung im Vergleich zu frei schwebenden, nicht erfassten QDs. Der starke Verstärkungsfaktor ermöglicht die Einzel-QD-Bildgebung mit nur einem Objektiv mit NA = 0,5. Links ist ein Beispiel für ein PCEF-Zeilenscanbild dargestellt. Bild aufgenommen mit einer EMCCD-Kamera (Hamamatsu) mit Verstärkung = 1, Empfindlichkeitsverstärkung = 100 (EM-Verstärkung 40× von 1200×), Integrationszeit = 600 ms. Laserleistung = 1 mW. Objektiv: ×50, NA = 0,5. PC-Pumpmodus: On-Resonance. Zeitspuren beugungsbegrenzter Punktintensitäten (rechts) werden verwendet, um einzelne QDs anhand ihrer charakteristischen zweistufigen Intensitätsverteilungen zu identifizieren (Objektiv: ×50, NA = 0,5). c Darstellung eines verstärkten Anregungsfeldes. Die roten Pfeile bezeichnen die QD-Emissionen. d Darstellung der verbesserten Extraktionsrate und Sammeleffizienz. Orangefarbene Bereiche zeigen die räumliche Verteilung der QD-Emissionen auf Glas und PC. Die gelben Markierungen im PC zeigen die Modenprofilverteilung seines Fluoreszenzmodus an. Von QD emittierte Photonen werden zunächst an den Fluoreszenzmodus des PC gekoppelt, der mit einer höheren Extraktionsrate in einem bestimmten Winkel, der vom Sammelbereich der Objektivlinse (hellgrau) abgedeckt wird, in das Fernfeld zurückstrahlt. e Darstellung der erhöhten spontanen Emissionsrate und der Unterdrückung des Blinkens.

Die Wechselwirkung von Licht mit fluoreszierenden QD-Tags kann in Gegenwart optischer Resonanzen25, 44, 45 durch fünf Mechanismen dramatisch verändert werden: (i) Erhöhung der Absorption (Anregungsrate) der Moleküle durch Kopplung des Anregungspumpfelds in einen verglichenen Resonanzmodus mit Massenabsorption (Abb. 1c), (ii) Erhöhung der Extraktionsrate erzeugter Photonen in das Fernfeld in Gegenwart von PC im Vergleich zur Platzierung im freien Raum (Abb. 1d), (iii) Verbesserung der spontanen Emission Rate und Strahlungsquanteneffizienz durch Modifizierung der photonischen Umgebung von Emittern im Vergleich zu einer nicht modifizierenden Umgebung46 (Abb. 1e), (iv) Verbesserung der Sammeleffizienz durch Umlenkung des emittierten Lichts in bevorzugte Auskopplungsrichtungen (Abb. 1d) und (v) Blinkunterdrückung (Abb. 1e). Erstens ist der PC so konzipiert, dass er einen resonanten optischen Pumpmodus bei der Wellenlänge der Laserbeleuchtung unterstützt und im Gegenzug ein verstärktes elektromagnetisches Feld zur Anregung oberflächengebundener QDs erzeugt. Der verbesserte Anregungsmechanismus ermöglicht eine erhebliche Absorption der Pumpenergie für QDs in der Nähe der PC-Oberfläche und erzeugt mehr Photonen als dieselben QDs in Kontakt mit einer unstrukturierten Glasoberfläche. Zweitens koppelt sich das QD-Emissionslicht mit dem PC-Fluoreszenzmodus und strahlt mit einer höheren Extraktionsrate in das Fernfeld, sodass während einer einzigen Bildintegrationszeit mehr Photonen erfasst werden. Drittens erzeugt das dielektrische PC durch den Purcell-Effekt eine Verbesserung der Quanteneffizienz, was zu einer kürzeren Lebensdauer der spontanen Emission und einer höheren Quanteneffizienz führt. Viertens sorgen die PC-Resonanzmodi für eine Photonendispersion, die die stark gerichtete Photonenwinkelverteilung im freien Raum bestimmt. Der gerichtete Emissionsmechanismus gewährleistet eine höhere Effizienz der Photonensammlung vom PC durch die strategische Auswahl eines Mikroskopobjektivs, dessen NA die Winkel für eine bekannte QD-Emissionswellenlänge berücksichtigt. Darüber hinaus zeigen wir, dass das Vorhandensein von QDs auf dem PC zu einer Unterdrückung des QD-Blinkens führt, bei der der QD für einen größeren Teil der Zeit in seinem „Ein“-Zustand bleibt. Ein Schlüsselelement der aktuellen Studie liegt in der Kombination mehrerer unabhängiger multiplikativer Effekte, die eine PC-Oberfläche nutzen, um eine beispiellose 3000-fache Verbesserung der QD-Emission mit Blinkunterdrückung zu erreichen, was die Beobachtung einzelner QDs mit einem Objektiv mit niedriger NA bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen ermöglicht Signal-Rausch-Verhältnis, ein großes Sichtfeld und Verbesserung von Signalunterbrechungen.

Eine Anregungsverstärkung tritt auf, wenn der PC einen Pumpresonanzmodus bei der Wellenlänge des Anregungslasers unterstützt, der das lokale elektrische Feld verstärkt (Abb. 1c). Das PC-QD-System (siehe ergänzende Abbildung S1a – e) besteht aus QDs, die über biomolekulare Bindungen mit der Oberfläche einer dielektrischen PC-Platte verbunden sind. Abbildung 2a zeigt ein repräsentatives Rasterelektronenmikroskopbild (REM) des PC-QD-Systems. Die PC-Platte unterstützt photonische kristallgeführte Resonanzen (PCGRs) in einer Si3N4-Dünnfilmbeschichtung (n = 2,05) auf einem periodisch modulierten SiO2-Substrat (n = 1,46). Die Oberfläche wird in wässrige Medien eingetaucht und von der Rückseite mit einem transversal elektrisch (TE-) polarisierten Laser (λLaser = 450 nm) im Einfallswinkel θ angeregt. Wenn der Einfallswinkel des Lasers die Phasenanpassungsbedingung des PC erfüllt, wird er durch Bragg-Streuung erster Ordnung als sich ausbreitende geführte Moden gekoppelt47. Das Anregungslicht breitet sich dann innerhalb des PC über den resonanzunterstützten Transportweg aus und bildet „undichte Eigenmoden“, die entlang der PC-Oberfläche (die sich bis in das bedeckende wässrige Medium erstreckt) für eine endliche Lebensdauer τ mit abstimmbarer Lorentz-Linienformresonanz in begrenzt sind der Frequenzbereich19. Mit kontinuierlicher Eingangsenergie aus einfallendem Licht dient der PC als resonanter optischer Hohlraum, der Photonenenergie speichert. Infolgedessen kann das lokale Anregungsfeld um Größenordnungen höher sein als auf einer gewöhnlichen unstrukturierten Oberfläche (Abb. 2b) und daher zu einer verstärkten Absorption für oberflächengebundene QDs führen. Bei Resonanz wird eine starke Nahfeldintensität in der Nähe der Oberfläche aufgebaut und der Resonanzmodus erstreckt sich durch die evaneszenten Feldschwänze über die gesamte makroskopische Oberfläche (Abb. 1c). Diese delokalisierte Eigenschaft hat dem PC Möglichkeiten eröffnet, problemlos mit hinzugefügten QD-Tags überall auf der großen PC-Oberfläche (in der x-y-Ebene) in unmittelbarer Nähe in z-Richtung (<100 nm, feine Z-Schnitte) zu interagieren.

ein REM-Bild des PC-QD-gekoppelten Systems bei 40k-Vergrößerung. Maßstabsbalken, 1 µm. Der linke Einschub zeigt einen vergrößerten Bereich für Details bei 130k-Vergrößerung mit einem Maßstabsbalken von 100 nm. Der rechte Einschub zeigt ein TEM-Bild des QD-605 in 600k-Vergrößerung. Maßstabsbalken, 10 nm. Mehr als drei Experimente wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. b FDTD-Simulation der Nahfeldintensitätsverteilung des PC-Querschnitts, sowohl in der Resonanz (θ = 9,2°, links) als auch außerhalb der Resonanz (θ = 20°, rechts). c Winkelaufgelöste Emissionsspektrummessungen für QD-605 in Verbindung mit dem erweiterten Fluoreszenzmodus (grün) und einzeln auf Glas (blau), beide mit einem Sammelwinkel von 26°. d Oberes Feld: Numerische Simulation für die 2D-Abbildung des Purcell-Verstärkungsfaktors (Fp) als Funktion der Position auf der PC-Oberfläche. Es wird ein einzelner Dipol verwendet und es wird davon ausgegangen, dass er in x-Richtung ausgerichtet ist. Unteres Feld: Topografische Abbildung der PC-Oberfläche mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM), x = 1,13 μm, y = 0,4 μm, Z-Höhe reicht von 0 nm (Rille) bis 28 nm (Rippe). e Simuliertes Fernfeldstrahlungsmuster von der PC-Oberfläche (blaue Kurve) und dem Glas (rote Kurve). Weiße Regionen stellen Winkelregionen dar, die mit NA = 0,5 erfasst werden. f Simulation winkelaufgelöster PC-Reflexionsspektren (Bandstruktur).

Da die räumliche Überlappung zwischen QDs (durchschnittlicher Radius ~ 4 nm) und dem Pumpresonanzmodus im Vergleich zur Wellenlänge typischerweise klein ist, wird nur ein kleiner Teil der Anregungsenergie absorbiert45. Hier definieren wir die von einer einzelnen QD-Schicht absorbierte Leistung als \({P}_{{{\rm {Glass}}}}^{{{\rm {abs}}}}=\left({N}_ {0}{\sigma }_{{{\rm {QD}}}}d\right)\times {P}_{{{\rm {in}}}}\), wobei σQD der Absorptionsquerschnitt ist. Abschnitt der Moleküle, N0 ist die Anzahldichte der Moleküle, d ist die Dicke der QD-Einzelschicht und Pin ist die Anregungspumpleistung. Basierend auf dem TCMT-Modell (Temporal Coupled Mode Theory)20, 21 definieren wir den Anregungsverstärkungsfaktor wie folgt:

Der Verhältnisterm \({({Q}^{{\rm {P}}})}^{2}/{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}} \) beschreibt, wie viel eingegebene Anregungsenergie durch den Pumpresonanzmodus in der optischen Resonanz gespeichert wird. Wir haben den Energiebeschränkungsfaktor \({\alpha }^{{\rm {P}}}={\int }_{{\rm {QDlayer}}}{|{{{{{{\bf{E}} angewendet. }}}}}}_{{{{{\bf{k}}}}}},{\omega }_{{{{{{\bf{k}}}}}}}}^{{ \rm {P}}}({{{{{\bf{r}}}}}})|}^{2}{\rm {d}}{{{{{\bf{r}}}} }}\), um den Anteil der oben genannten modengespeicherten Energie zu charakterisieren, die in der QD-Schicht lokalisiert ist, während \({{{{{\bf{E}}}}}}}_{{{{{{\bf{ k}}}}}},{\omega }_{{{{{\bf{k}}}}}}}}^{{\rm {P}}}({{{{{\bf{ r}}}}}})\) ist das normalisierte elektrische Feld des Pumplasers. Da der Laser durch die Unterseite des Substrats einfällt, sollte hier der nach unten gerichtete Strahlungsqualitätsfaktor als \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}}={Q }_{{\rm {r,tot}}}^{{\rm {P}}}\cdot \frac{{S}^{{\rm {P,tot}}}}{{S}^{ {\rm {P,down}}}}\), wobei \({S}^{{\rm {P,down}}}\) der nach unten gerichtete Strahlungsfluss ist und \({S}^{{\rm {P,tot}}}\) ist der gesamte Strahlungsfluss.

Der zweite Mechanismus ist die Erhöhung der Extraktionsrate aufgrund einer starken Änderung der spektralen Zustandsdichte (SDOS) in Gegenwart von Fano-Resonanzen. Die spektrale und Winkelemission von QDs kann sich im Vergleich zu der im freien Raum dramatisch verändern, wenn sie an eine makroskopische Nanostrukturresonanz gekoppelt wird. Wie in Abb. 2c gezeigt, werden scharfe spektrale Merkmale in den Fluoreszenzspektren beobachtet. In ähnlicher Weise definieren wir den Extraktionsverstärkungsfaktor bei Kopplung mit der QD-Fluoreszenzresonanz als das Verhältnis zwischen der Extraktionsrate in das Fernfeld in Gegenwart von PC (\({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\times \frac{{Q}^{{\rm {F}}}}{{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}}\)) verglichen mit der Rate in freier Speicherplatz (\({\varGamma }^{{\rm {frei}}}\)):

wobei \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\) und QF repräsentativ der Strahlungs- und Gesamtqualitätsfaktor des QD-Fluoreszenzkanals sind. Der Faktor \({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\) wurde in einer früheren Studie45 als die Rate definiert, mit der eine gleichmäßige und isotrope Ansammlung von Molekülen Photonen mit dem Kristallimpuls k bei der Resonanzfrequenz ωk erzeugt. Wir verwenden den Gesamtstrahlungsqualitätsfaktor anstelle des Abwärtsstrahlungsqualitätsfaktors, da wir das Abwärtsstrahlungsverhältnis später in der CE-Berechnung berücksichtigen werden.

Darüber hinaus steht die Nahfeldresonanz in direktem Zusammenhang mit ihren Fernfeldeigenschaften. Im Fernfeld haben wir festgestellt, dass der PCGR-Transportweg konstruktiv mit der direkten Hintergrundreflexion interferiert und zu einem Reflexionspeak bei der Resonanzwellenlänge führt. Nach Betrachtung des Reflexionsspektrums des PC-Banddiagramms (Abb. 2f) konstruieren wir den PC mit einem moderaten Qualitätsfaktor des Pumpmodus (\({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm { P}}}=\frac{{\lambda }_{0}}{\varDelta \lambda }\ approx 130,19{{{{\rm{@}}}}}}450\,{{{{{\ rm{nm}}}}}}\)), wenn ein bei 9,2° einfallender Laser mit der QD-Anregungswellenlänge übereinstimmt. Ergänzende Abbildung S2 zeigt das simulierte PC-Reflexionsspektrum, wenn der PC für den Pumpmodus bei der QD-Anregungswellenlänge in Resonanz (hellgrüner Stern) und außerhalb der Resonanz (dunkelgrüner Punkt) ist. Das experimentell gemessene PC-Reflexionsspektrum wird als überlagerte Graupunkte mit einem QP ≈ 106,41 dargestellt. In ähnlicher Weise werden die QD-Emissionsspektren in Abb. 1c zwischen PCGR-gekoppeltem Fluoreszenzmodus (grün) und ungekoppelter Emission (blau) verglichen. Mit Qualitätsfaktoren \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\ungefähr 225,08\) (Simulation entworfen) und QF ≈ 115,87 (experimentell gemessen) bei λQD = 605 nm . Darüber hinaus wird die Kern-Schale-Struktur eines einzelnen QD-605 mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) klar aufgelöst (Abb. 1a, Einschub), und der durchschnittliche Radius wurde mit etwa 4 nm gemessen (ergänzende Abbildung S7). Unter der Annahme einer 4 nm dicken QD-Schicht über der PC-Gitteroberfläche werden der theoretische Anregungs- und Verstärkungsfaktor zu \({\Lambda }_{{{\rm {Anregung}}}}\ungefähr 21,84\) und \({ \Lambda }_{{{\rm {Extraktion}}}}\ungefähr 34,39\) (siehe Ergänzungsteil 4).

Bevor die von QD emittierten Photonen mit dem PC-Extraktionsmodus koppeln und mit einer höheren Auskopplungsgeschwindigkeit in das Fernfeld austreten, wird auch der Prozess der spontanen Emission modifiziert (Abb. 1f). Aufgrund der Nahfeldverstärkung und der erhöhten Zustandsdichte erfahren QDs, die auf der Oberfläche des PCs platziert werden, auch eine Steigerung ihrer spontanen Emissionsrate. Dieser Purcell-Effekt verstärkt die QD-Emission durch Änderung der Quanteneffizienz (QE), ohne die strahlungslose Zerfallsrate zu erhöhen, da dielektrisches Material verlustfrei ist. Die verbesserte Quanteneffizienz für QD-605 auf dem PC (QEPC) kann mithilfe der folgenden Gleichung geschätzt werden:

Dabei sind γrad,PC, γnonrad,PC und γloss,PC die Strahlungs-, Nichtstrahlungs- und Verlustraten des QD auf der PC-Oberfläche. Wir gehen davon aus, dass das dielektrische PC-System keine zusätzlichen Verlustkanäle erzeugt (γloss,PC = 0) und die intrinsische strahlungslose Zerfallsrate nicht verändert (γnonrad,PC = γnonrad,i).

Das obere Feld in Abb. 2d zeigt die 2D-Abbildung des simulierten Purcell-Verstärkungsfaktors (Fp) als Funktion der Position auf der PC-Oberfläche. Fp wird durch das relative Verhältnis der modifizierten spontanen Emissionsratenänderung im Vergleich zur ursprünglichen Emissionsrate auf Glas berechnet. Basierend auf dem AFM-Bild im unteren Bereich richten wir die Purcell-Faktor-2D-Abbildung an der topografischen Struktur der PC-Gitteroberfläche aus. Wenn die QDs mit dem PC-Fluoreszenzmodus in Resonanz sind, bieten die Gratbereiche eine höhere Purcell-Verstärkung als die Rillen und erreichen den größten Wert an den Gitterkanten. Dieses dielektrische PC-System kann theoretisch eine 3–5-fache Steigerung der spontanen Emissionsrate \({\gamma }_{{{\rm {SP}}}}^{{{\rm {PC}}}}\) relativ bewirken zur ursprünglichen Emissionsrate \({\gamma }_{{{\rm {SP}}}}^{0}\) auf unstrukturiertem Glas.

Darüber hinaus kann das verstärkte Fluoreszenzlicht durch Nahfeldinteraktion in PCGR-Modi eingekoppelt und zur Sammlung durch das Mikroskopobjektiv in den freien Raum abgestrahlt werden (Abb. 1d). Das PC-Dispersionsbanddiagramm (Abb. 2f) bestimmt, wie emittierte Photonen in bevorzugte Richtungen zum Mikroskopobjektiv umgelenkt werden (verbesserte Sammeleffizienz). In unserem System wurde der PC so konstruiert, dass er einen Dispersionswinkel für 605-nm-Emission bei 25,8° bietet, um sicherzustellen, dass die extrahierte Emission innerhalb einer begrenzten numerischen Apertur (30° für NA = 0,5 Objektivlinse) auftritt.

Das Fernfeldstrahlungsmuster und die Sammeleffizienz der QD-Auskopplung werden mithilfe der Finite-Differenzen-Zeitdomänen-Methode (FDTD) berechnet (siehe ergänzende Teile 6 und 7). Die blauen und roten Kurven in Abb. 3d zeigen die Fernfeldstrahlungsverteilung von QDs auf PC- bzw. Glassubstraten in einer polaren Darstellung. Um die verbesserte Sammeleffizienz zu quantifizieren, definieren wir den Parameter \({{\rm {CE}}}=\frac{{S}_{{{\rm {col}}}}}{{S}_{{{ \rm {tot}}}}}\) als Verhältnis der gesammelten Leistung, die in das Mikroskopobjektiv gelangt (Scol), zur Gesamtleistung, die von einem einzelnen Molekül emittiert wird (Stot). Simulationsergebnisse (siehe ergänzender Teil 6) deuten auf eine 3,51-fache Verbesserung der Sammeleffizienz (CE) von 5,19 % (auf Glas) auf 18,21 % (auf PC) hin, wenn die Emission von unten mit einer Objektivlinse mit NA = 0,5 gesammelt wird. Um die Winkelverteilung des Emissionsmusters und seine Richtung zu untersuchen, haben wir eine einzelne QD-Emissionsverteilung in der hinteren Brennebene (BFP) der Objektivlinse abgebildet. Zwei Einschübe in Abb. 3d zeigen sowohl experimentell aufgezeichnete (blauer Farbbalken) als auch numerische Simulationen (roter Farbbalken) als doppelte hyperbelförmige Bänder. Die blauen Punkte in der Hauptabbildung zeigen die experimentell gemessene normalisierte Leistungsverteilung als Funktion sowohl des Sammelwinkels als auch der numerischen Aperturgrenzen. Die rote Kurve in Abb. 3d bestätigt, dass die numerische Simulation bemerkenswert gut mit den experimentellen Daten übereinstimmt. Die QD-605-Emission (FWHM = 28 nm, siehe ergänzende Informationen) ist hauptsächlich auf zwei um 25,8° zentrierte Keulen mit einer Halbwertsbreite von 9,2° Winkelverteilung beschränkt.

a Experimentelle Ergebnisse für verstärkte Anregungseffekte. Vergrößertes Einzel-QD-Bild unter PCGR-verstärkten (links) und nichtverstärkten Bedingungen (rechts) nur für den Pumpenmodus. Der Verstärkungsfaktor wird durch \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}},{\exp }}\)= (IE−I0)/I0 nach Hintergrundkorrektur berechnet, wobei IE die einzelne QD-Intensität ist wenn der PC-Pumpmodus eingeschaltet ist und I0 die einzelne QD-Intensität ist, wenn der PC-Pumpmodus ausgeschaltet ist. Da sich QDs immer auf der Oberfläche des PCs befinden, sind die Verbesserungen durch Extraktion, QY und Sammeleffizienz in beiden Fällen gleich. b Experimentelle Ergebnisse für verbesserte Extraktionsrate und Quanteneffizienz (QE)-Effekte. Erweiterte (links) und nicht verbesserte Bedingungen (rechts) für verbesserte Extraktionsrate und QE-Effekte. Lasereinfallswinkel: 20°. Resonanz im Pumpenmodus ausgeschaltet. Die Verbesserung der Sammeleffizienz ist vernachlässigbar, wenn Ölimmersionsobjektive mit NA = 1,46 verwendet werden. c TRPL-Messungen für Ensemble-QDs ermittelten die durchschnittliche Abklingzeit auf Glas (gelb) und auf dem PC (blau). Die \({\chi }^{2}\)-Werte sind <1,2, um die Qualität der Kurvenanpassung sicherzustellen. d BFP-Bilder und Winkelverteilung der Emission. Theoretische (rot) und gemessene (blau) Winkelemissionsintensität für einen einzelnen QD-605 (Zentrum bei 604,4 nm mit FWHM-Bereich von 590,4 bis 618,4 nm). Einschübe: Theoretische (rot, NA = 1) und experimentell gemessene (blau, NA = 0,8, in Luft) Bilder der hinteren Brennebene des einzelnen QD. Die beiden vertikalen gestrichelten Linien geben den maximalen Sammelwinkel der Objektive an (NA = 0,5 und NA = 0,8). e Blinkunterdrückung für QDs gekoppelt mit dem PCGR-Modus. Zeitspur (linkes Feld, blau), Intensitätshistogramm zweier unterschiedlicher Zustände (mittleres Feld, blau) und die Ein-/Aus-Zeit-Wahrscheinlichkeitsverteilungen folgen dem Potenzgesetz für QD auf dem PC (rechtes Feld, blau). f Blinkt für QDs auf der Glasoberfläche. Zeitspur (linkes Feld, gelb), Intensitätshistogramm zweier unterschiedlicher Zustände (mittleres Feld, gelb) und die Ein-/Aus-Zeit-Wahrscheinlichkeitsverteilungen folgen dem Potenzgesetz für QD auf dem PC (rechtes Feld, gelb). Integrationszeit: 100 ms, Objektivlinse: ×100, NA = 1,46, Ölemission. Laserleistung = 2,1 mW. PC-Pumpmodus: Off-Resonance. Alle vier Verteilungen gehorchen einem Potenzgesetz: \({P}_{(t)}\propto {t}^{\alpha }\), wobei \({\alpha }_{{{\rm {on}}} }\) = −0,98 und \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −1,71 für QD auf dem PC. \({\alpha }_{{{\rm {on}}}}\) = −1,63 und \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −0,95 für QD on Glas.

Die digitale Erfassung einzelner Moleküle ermöglicht nicht nur eine binäre Entscheidung für jedes nachweisbare Signal, sondern erweitert auch die Nachweisgrenze quantitativer Informationen durch diskrete Zählung für Analyten mit niedriger Konzentration (subnanomolar)49. Um die Fähigkeit zur Einzelmoleküldetektion und die experimentellen Verstärkungsfaktoren des PC-verstärkten Fluoreszenzmikroskops (PCEF) zu untersuchen, wurde ein Zeilenscan-Experiment durchgeführt, während der PC im Resonanzzustand beleuchtet wurde. Die Laserlinie schneidet einen diskreten Satz einzelner QDs, die deutlich über dem Hintergrund erkennbar sind. Das schematische Diagramm des PCEF-Mikroskopieaufbaus ist insbesondere in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt, in der eine Halbwellenplatte die Hauptpolarisation einer kollimierten blauen Laserdiode (TE, 450 nm, 1–5 mW) dreht, die senkrecht zum PC ausgerichtet ist nach Passieren eines linearen Polarisators. Durch eine Zylinderlinse fokussiert, wird der einfallende Strahl auf ein Linienprofil fokussiert (in der Zy-Ebene fokussiert, während er in der Zx-Ebene kollimiert wird) und auf die hintere Brennebene (BFP) der Objektivlinse ausgerichtet (×50, NA = 0,5). Die Unterfigur in der unteren rechten Ecke (SI Abb. S3) beschreibt, wie der Einfallswinkel θinc durch translatorische Verschiebung der Fokuslinie (Δx-Verschiebung) auf dem BFP durch Fourier-Transformation präzise eingestellt werden kann. Der PC ist auf einem motorisierten Probentisch montiert und bewegt sich senkrecht zur Laserlinie, um ein Linienscannen durchzuführen. Die Regel zur Auswahl des Einfallswinkels aus der Phasenanpassungsbedingung ermöglicht einen direkten Vergleich der Nahfeldverteilung, der Anregungsintensität und der QD-verstärkten Emission sowohl im photonischen Resonator (PC-QD-gekoppelter Modus) als auch in einem unstrukturierten Substrat (einzelner QD).

Jeder beugungsbegrenzte Emissionsort wird anschließend durch Analyse von Intensitätsschwankungen im Zeitbereich untersucht, um zu zeigen, dass die Emission von einem einzelnen QD und nicht von QD-Aggregaten stammt. Wir zeigen, dass die PC-Mehrfachverbesserungen für die Verstärkung des QD-Emissionssignals verantwortlich sind und dass das System durch Beobachtung der charakteristischen binären Emissionssignaturen des Single-QD-Blinkens Single-QD-Erkennungsgrenzen bietet. Abbildung 1b zeigt die verbesserte Zeilen-QD-Bildgebung über eine 120 µm × 120 µm große PC-Oberfläche unter Verwendung des selbstgebauten inversen Rastermikroskops30 mit präzise abgestimmtem Einfallswinkel (~0,025° Genauigkeit) auf den unterstützenden On-Resonance-PCGR-Modus. Der einfallende Strahl wird auf eine Linie (1,5 µm × 0,5 mm) fokussiert, die entlang der x-Achse auf der PC-Oberfläche (senkrecht zum Gitter) ausgerichtet ist und entlang der y-Achse scannt. Um den exakten Resonanzwinkel im Prüfbereich zu ermitteln und so die winkelempfindlich verstärkte Anregung sicherzustellen, wird ein automatischer Winkelscantest durchgeführt.

Der Anregungsverstärkungsfaktor der Einzel-QD-Bildgebung wurde sowohl im PCGR-verstärkten (Pumpmodus-Einschaltresonanz, Abb. 3a) als auch im nichtverstärkten Fall (Pumpmodus-Ausschaltresonanz, Abb. 2b, θ = 20°) verglichen. Der experimentell aufgelöste durchschnittliche Verstärkungsfaktor von \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}},{\exp }}\ approx\) 23,14 (Stichprobengröße von 100 einzelnen QDs) stimmt mit dem simulierten Ergebnis im vorherigen überein Abschnitt. Der Einschub von Abb. 3a zeigt das linear kontrastverstärkte Bild für das unverstärkte Bild im gleichen Pumpmodus. Ohne die Anregungsverstärkung durch den PC sind wir nicht in der Lage, ein QD-Signal über dem relativ verrauschten Hintergrund mit der gleichen Anregungsleistung (1 mW), Objektivlinse (NA = 0,5) und CCD-Integrationszeit (0,6 s) klar aufzulösen unser System. Diese Ergebnisse gehen über frühere Berichte hinaus50, 51 und zeigen, dass einzelne QDs mit einer Objektivlinse mit niedriger NA (nur 0,5 im Vergleich zu 1,4–1,46 in früheren Berichten) und normaler inverser Mikroskopie mit mehreren Verstärkungen von der PC-Oberfläche aus beobachtet werden können. Bindungswechselwirkungen zwischen einzelnen Molekülen wurden durch die Nutzung des QD-Blinkphänomens weiter charakterisiert50, 52,53,54. Die Intensitätskurve im Zeitbereich (Abb. 1b) wurde für eine Reihe von Bildern aufgezeichnet, die aufgenommen wurden, während die Laserlinie mit einer Integrationszeit von 100 ms an einer festen Position gehalten wurde. Die Pixelintensität wird aus dem Durchschnittswert (16-Bit-Rohdaten) eines einzelnen beugungsbegrenzten hellen Flecks berechnet. Zwei unterschiedliche Intensitätszustände (IQD und IB) können aufgrund der gelegentlichen Unterbrechung der Emission deutlich unterschieden werden und entsprechen der intrinsischen QD-Intensität und dem Gesamthintergrund. Wir führen die signifikante Lücke zwischen QD-Signal und Hintergrund auf die außerordentliche Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zurück (SNR = \(\frac{\left|{I}_{{{\rm {QD}}}}-{I} _{{\rm {B}}}\right|}{{\sigma }_{{{\rm {Rauschen}}}}}\), erhöht von <1 auf 59,31) durch PC-Oberflächenverbesserung.

Da die Verbesserungen der Extraktionsrate und der Quanteneffizienz immer für einen QD auf der PC-Oberfläche vorhanden sind, untersuchen wir die experimentellen Verbesserungsfaktoren (\({\Lambda }_{{{\rm {Extraktion}}},{\exp } }\) und \({\eta }_{{{\rm {QE}}}}=\frac{{{{\rm {QE}}}}_{{{\rm {pc}}}}} {{{{\rm {QE}}}}_{0}}\)) durch Vergleich der Einzel-QD-Bildgebung, wenn sich der QD auf dem PC befindet (während der Pumpmodus außerhalb der Resonanz liegt) und auf einer Glasoberfläche. Eine größere NA (1,46, Ölimmersion, ×100, Zeiss α Plan-APO-CHROMAT) und eine höhere Lasereingangsleistung (2,1 mW) werden verwendet, um einzelne QDs auf der Glasoberfläche zu beobachten. Abbildung 3b zeigt den Vergleich zwischen der einzelnen QD-Emissionsdifferenz, die durch verbesserte Extraktion erzielt wird, und der verbesserten QY bei einzelnen QDs auf PC (links) und auf Glas (rechts). Hier traf der Laser in einem Winkel von 20° ein (außerhalb der Resonanz für den Pumpmodus), um die verstärkten Anregungseffekte des PC zu eliminieren. Die Verbesserung der Sammeleffizienz ist bei Verwendung des Objektivs mit hoher NA vernachlässigbar. Somit wird der Faktor der verbesserten Extraktion und QY durch \(\scriptstyle{\Lambda }_{{{\rm {Extraktion}}},{\exp }}\cdot {\eta }_{{{\rm { QE}}}}=\frac{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {PC}}}}-{I}_{{{\rm {QD}} }}^{{{\rm {Glass}}}}}{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {Glass}}}}}\) nach Hintergrundkorrektur. Basierend auf einer Stichprobengröße von 100 einzelnen QDs wurde ein durchschnittlicher Extraktionsverstärkungsfaktor von ~38,63 berechnet, der mit den oben genannten Simulationsdaten vergleichbar ist.

Ähnlich wie bei der numerischen Simulation zeigt unsere zeitaufgelöste Photolumineszenzmessung (TRPL) einen experimentellen Purcell-Faktor von ~3,11 für Ensemble-QDs auf der PC-Oberfläche im Vergleich zu Glas. Wie in Abb. 3c dargestellt, beträgt die durchschnittliche Abklingzeit von τGlas = 5,32 ns (±0,24 ns), während τpc = 1,71 ns (±0,31 ns) beträgt. Die berechnete Emissionsrate hängt von der lateralen Position des QD auf der PC-Oberfläche ab und bleibt für einen breiten Wellenlängenbereich (500–700 nm) einzelner Fluoreszenzemitter konstant (siehe ergänzende Abbildung S6). Die intrinsische Quanteneffizienz (QEi = 40,84 %) für QD-605 auf Glasobjektträgern, erhalten in (Ergänzungsteil 9 und Abb. S5), wurde verwendet, um das Verhältnis der intrinsischen nichtstrahlenden und strahlenden Zerfallsrate (\({\gamma }_{{{\rm {non}-{rad},i}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i}}}=0,4084\)). Unter Verwendung von Gl. (3) und der experimentell aufgelöste durchschnittliche Purcell-Verstärkungsfaktor \(({\gamma }_{{{\rm {rad},{PC}}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i }}}=3,11)\) können wir \({{{{{{\rm{QE}}}}}}}_{{{\rm {PC}}}}\) auf 68,22 % schätzen. und der QE-Verstärkungsfaktor \(({{\eta }_{{{\rm {QE}}}}={{\rm {QE}}}}_{{{\rm {PC}}}}/{ {{\rm {QE}}}}_{{\rm {i}}})\) zu 1,67.

Die lokale Dichte verfügbarer Photonenzustände ist im QD-PC-gekoppelten System im Vergleich zu einem einzelnen QD erhöht. Dies beschleunigt den Strahlungszerfall, bei dem ein QD im angeregten Zustand mit verkürzter Lebensdauer (schnellere Zerfallsrate) in den Grundzustand übergeht und spontan Photonen emittiert. Die höhere Geschwindigkeit dieses Strahlungszerfallsprozesses konkurriert günstig mit den anderen nichtstrahlenden Zerfallswegen, bei denen ein Elektron durch Auger-Rekombination und/oder Oberflächeneinfang verloren geht, was zu Aus-Zuständen führt55, 56 und dadurch das Blinken unterdrückt. Abbildung 2h zeigt die Blinkunterdrückung für einen QD gekoppelt mit dem PCGR-Modus. Der Schwellenwert ist als das Doppelte des mittleren Hintergrundpegels definiert. Wir berechnen, dass der Anteil der Betriebszeiten bei PC 87,21 % und bei Glas 14,49 % beträgt. Ähnliche Werte wurden erhalten, wenn der Schwellenwert als Minimum zwischen den beiden unterschiedlichen Spitzen im Ein- und Aus-Zustand definiert wurde. Die Wahrscheinlichkeiten der Ein- und Ausschaltperioden für einen QD sowohl auf PC (blau) als auch auf Glas (gelb) wurden an eine Potenzgesetzverteilung der Form angepasst, wie in Abb. 3f gezeigt, dem Leistungsparameter für die „Ein“-Zeit , αon = −1,63, für QD auf dem Glasgehäuse, während der „off“-Parameter, αoff = −0,95. Für die QD auf dem PC (Abb. 3e) betrugen die Ein- und Aus-Wahrscheinlichkeitsparameter αon = –0,98, αoff = –1,71, was eine erhöhte Wahrscheinlichkeit von Ein-Ereignissen und eine verringerte Wahrscheinlichkeit von Aus-Ereignissen zeigt.

Nachdem wir die Fähigkeit demonstriert hatten, Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis einzelner auf einer PC-Oberfläche immobilisierter QDs zu erfassen, versuchten wir als Nächstes, QDs als biomolekulare Tags für einen enzymfreien miRNA-Assay zu verwenden, bei dem jedes Ziel-miRNA-Molekül in der Testprobe dies tun kann Dies führt zur Anbringung eines QD-Tags an der PC-Oberfläche. Wir bezeichnen diese Art der Detektion als digitale Auflösung, da jede QD gezählt werden kann, um ein direktes quantitatives Maß zu erhalten, das keine enzymatische Amplifikation von Zielmolekülen erfordert, bei der erwartet wird, dass Zielmoleküle in geringer Konzentration zu Tags führen, die in geringer Entfernung verteilt sind Dichte über die Detektionsfläche. Darüber hinaus wünschen wir uns einen molekularbiologischen Ansatz, der für die Ziel-miRNA-Sequenz hochselektiv ist, was dazu führt, dass QD-Tags für Nicht-Zielsequenzen nicht erfasst werden.

Nach jüngsten Arbeiten, die miR-375-Spiegel im menschlichen Serum mit der Metastasierung, Aggressivität und Überlebensprognose von Prostatakrebs in Verbindung bringen57,58,59,60, haben wir diesen Biomarker als erstes Ziel für die Charakterisierung der Fähigkeiten unserer Erkennungsplattform ausgewählt. In Abb. 1a wurde der PC als Biosensorsubstrat für einen brückenaktivierten Assay verwendet, bei dem gegenüberliegende Seiten des miRNA-Zielmoleküls an komplementäre Einzelstrang-Nukleinsäuresequenzen binden, die auf dem QD und dem PC immobilisiert sind. Daher müssen zwei hochspezifische Nukleinsäurebindungswechselwirkungen auftreten, damit ein QD eine starke Oberflächenbindung an den PC herstellt, und das miRNA-Zielmolekül dient als biomolekulare Brücke zwischen dem QD und dem PC (Abb. 4a).

a Im brückenaktivierten Assay-Prozess werden QD-Tags auf die PC-Oberfläche gezogen, wenn Ziel-miRNAs die Bildung eines oberflächengebundenen Komplexes überbrücken. b Darstellung des Zeilenscanvorgangs, der die Anzahl der am PC angeschlossenen QDs zählt. c Zeilenscan-Bildgebung: für PCEF-verstärkte digitale Zählung in menschlichem Serum. Zielkonzentration: 10 aM bis 1 nM. Sichtfeld: 300 µm × 300 µm. Maßstabsbalken: 40 µm. Bei den Daten handelt es sich um Durchschnittswerte aus mehr als 9 FOVs, und Fehlerbalken geben die Standardabweichung zwischen drei unabhängigen Replikaten an. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA zwischen der negativen Kontrollgruppe und allen Testgruppen mit P < 0,0001 getestet; Bildgebungsbedingungen für den Assay am PC: Laserleistung = 1 mW, EM-Verstärkung = 40×; Eine höhere Laserleistung (5 mW) und EM-Verstärkung (1200×) sind erforderlich, um die Intensitätsänderung bei 1–10 pM auf Glas zu erkennen und gleichzeitig eine Signalsättigung bei 1 nM zu vermeiden; In beiden Oberflächentests wurden die gleiche Integrationszeit (600 ms) und die gleichen Ziele (×50, NA = 0,5) angewendet. d Dosis-Wirkungs-Kurve für verschiedene Konzentrationen über einen 109-fachen Konzentrationsbereich nach einer 2-stündigen Inkubation für digitale Zählergebnisse. Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Tests dar. e Single-Base-Mismatch-Unterscheidungstest. Das Zeilenscan-Bildfeld zeigt die digitale Auflösung der erfassten QDs für die Zielgruppe miR375 Perfect Match (PM) im Vergleich zu drei verschiedenen SNVs bei 100 pM. f Quantifizierung der Perfect-Match-Zielsequenz und der SNV-Fälle bei einer Konzentration von 100 pM. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe unabhängiger T-Tests (zweiseitig) getestet. ****P < 0,0001. Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Tests dar.

Das PC wurde zunächst durch Aufdampfen einer gleichmäßigen Epoxid-Silan-Schicht hergestellt. Vor der Silanisierung wurde die PC-Oberfläche 10 Minuten lang mit Sauerstoff-Oberflächenplasma behandelt, um die Oberfläche zu aktivieren, indem eine Dichte an -OH-Gruppen erzeugt und organische Verunreinigungen entfernt wurden. Die gezeigten miR-spezifischen DNA-Sonden und Ziel-Oligos wurden mit NUPACK61 entworfen (siehe Ergänzungsteil 15). Die Pulldown-Capture-Nukleinsäuresondensequenz (gelb) ist eine einzelsträngige DNA (ssDNA) mit einer NH2−-Modifikation (Aminoradikalgruppe) am 5'-Ende zur kovalenten Bindung an die Silanisierungsschicht zur Funktionalisierung der PC-Oberfläche. ssDNA-Sonden (blau) werden durch eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung mit QD-Tags (68 nM) konjugiert und durch wiederholte Filtration gereinigt. Darüber hinaus entwerfen wir QD-markierte ssDNA-Sonden und Capture-Sequenzen mit 5-Basen-Oligo(T)-Linkern als Spacer, um sterische Effekte zwischen den QD- und PC-Oberflächen zu verhindern.

Das miR-375-Nachweisziel (rosa) umfasst 22 Nukleobasen, wobei das 5'-Ende (10 Basen) komplementär zur Einfangsequenz auf der PC-Oberfläche (gelb) und das 3'-Ende (12 Basen) komplementär zum QD ist -ssDNA-Sondensequenz (blau). Die komplementäre Natur dieser Basenpaarstruktur ermöglicht es der Ziel-miRNA, wie eine Brücke zu wirken, die die Verbindung zwischen Capture und QD-ssDNA-Sonde stabilisiert, indem sie einen DNA-RNA-Duplex bildet. Ohne die Brücke – die Ziel-miRNA – werden die fluoreszierenden Tags (QD-ssDNA-Sonde) nicht auf die PC-Oberfläche gezogen und erfahren daher nicht die oben erwähnte 3000-fache Verstärkung, selbst wenn sie vom Anregungslaser beleuchtet werden (Abb. 4b). Gemäß den neuesten Richtlinien für das Design spezifischer und robuster Hybridisierungssonden haben wir die Gibbs-Reaktionsenergie zwischen der DNA-Sonde und dem Ziel auf ungefähr Null (ΔG' ~ 0)62 optimiert. Bei ΔG' ~ 0 ist der durchschnittliche energetische Nachteil einer einzelnen Fehlpaarung größer (ΔΔG) als der Gewinn an freier Energie der perfekten Übereinstimmung, wodurch die Off-Target-Bindung mit nahezu optimaler Spezifität begrenzt wird und eine Hybridisierungsausbeute von 99,2 % erzielt wird (bei ΔG' ~ 0). 23 °C, Na+: 1 mM). NUPACK wurde zur Simulation der Gleichgewichtseigenschaften der Basenpaarung im Hinblick auf die Sekundärstruktur der Nukleinsäure und die freie Energie verwendet. Die Anzahl der Nukleinsäuren sowohl der Capture- als auch der ssDNA-Sonde wurde sorgfältig ausgewählt, um die Bildung unerwünschter Sekundärstrukturen zu minimieren. Wenn beispielsweise die Anzahl der Basen der Fängersequenz von 10 auf 12 steigt, bilden die Fänger-Oligos eine Haarnadelschleifenstruktur und haben keine Fähigkeit, sich mit dem unteren Teil der Ziel-miRNA zu paaren.

Da der PC ausschließlich die mit QD-Tags versehenen Sonden in unmittelbarer Nähe zur Oberfläche durch Verstärkung des evaneszenten Feldes und verbesserte geführte Extraktion verstärkt, bietet die PCGR-verstärkte Mikroskopie TIRF-ähnliche Z-Schnitte, die nur die Zählung von QD-Tags innerhalb von ~60 nm der Oberfläche ermöglichen . Folglich werden nur die heruntergezogenen QDs verstärkt und melden ein positives Signal für einzelne Bindungsereignisse; während die ungebundenen freien QDs nicht gezählt werden, da das unverstärkte Single mit Hintergrundrauschen vergleichbar ist. Darüber hinaus sind sowohl die PC-Oberfläche als auch die QD-Oberfläche anionisch, durch ssDNA-Sequenzen gebunden und neigen dazu, sich gegenseitig elektrostatisch abzustoßen, um eine unspezifische Adhäsion der QDs an der PC-Oberfläche zu verhindern. Der oben erwähnte zweistufige Assay wurde durchgeführt, indem nacheinander eine definierte Konzentration von miR-375 (4 Stunden) inkubiert wurde, gefolgt von der Zugabe einer konstanten Menge an ssDNA-QD-Sonden (2 Stunden) in eine Vertiefung mit PC-anhaftendem Polydimethylsiloxan (~45 μl pro Vertiefung). ). Jeder Inkubationsschritt wird von sanften Waschschritten begleitet, um die freien Ziele und ungebundenen QD-Tags zu entfernen.

Herkömmliche Oberflächen-Capture-Assays können fluoreszierend markierte Analyten über einen 1000-fachen Konzentrationsbereich und auf subnanomolarer Ebene messen, viele biologische Moleküle weisen jedoch mehr als 1.000.000-fache Schwankungen in der Häufigkeit bis hin zur subfemtomolaren Ebene auf. Auf digitaler PCR-Amplifikation basierende Assays können eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einem um bis zu fünf Größenordnungen verbesserten Dynamikbereich63,64,65 unter Verwendung einer präzisen Temperaturzyklussteuerung ermöglichen. Ohne enzymatische Amplifikation kann unsere bisherige Forschung66, die Einzelmolekülzählung und Intensitätskalibrierung kombiniert und den dynamischen Bereich von Fluoreszenzassays zeigt, auf einen ähnlichen Bereich (105-fach) erweitert werden und mit einem TIRF-Mikroskop mit einer NA = 1,46 eine Nachweisgrenze von ~10 fM erreichen , ×100-Objektiv und EMCCD mit hoher Verstärkung. Letztendlich zeigen wir, dass die Mehrfachverstärkung des PC-QD-Assays eine enzymfreie Biosensorik mit digitaler Auflösung für die direkte Zählung einzelner miRNAs mit kostengünstiger Optik (NA = 0,5-Objektiv, Laserdiode mit geringer Leistung und CCD mit geringer EM-Verstärkung) ermöglichen kann. Die direkte Zählfähigkeit liefert lineare Dosis-Wirkungs-Kennlinien, wenn sie auf einer Log-Log-Skala über einen Zielkonzentrationsbereich von 10 aM–1 nM aufgetragen werden, mit einer 10.000-fachen Verbesserung der Nachweisgrenze im Vergleich zur analogen Ensemble-Intensitätsmessung.

Zirkulierende miRNAs sind im menschlichen Serum sehr stabil67, und der direkte Nachweis von miR-375 im Serum wurde kürzlich als möglich erwiesen68. Um die Machbarkeit unserer QD-basierten digitalen Erfassung in einer unverarbeiteten nativen Probenmatrix zu demonstrieren, haben wir miR-375-Ziele in menschlichem Serum (Sigma-Aldrich, H3667) in 12 Endkonzentrationen im Bereich von 100 zM bis 10 nM versetzt und dann durchgeführt die Sensortests ohne Durchführung einer RNA-Extraktion oder -Reinigung. Abbildung 4c, d zeigt die PC-Zählergebnisse mit erhöhter digitaler Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen analogen Intensitätsmessungen aus einem glasoberflächenbasierten Assay (SI Abb. S14). Die Ergebnisse des Zeilenscans sind ausgewählte Darstellungen des oben genannten Tests für spezifische Konzentrationen der Ziel-miRNA in gepufferter Lösung. Das Zeilenscanmikroskop wurde so programmiert, dass es das QD-Emissionslicht von jedem Pixel innerhalb des Sichtfelds (FOV) für die QD-Tag-Zählung oder die Aufzeichnung der mittleren Intensität erfasst. Für jedes Testloch haben wir die Gesamtoberfläche mit einem FOV = 1 mm × 1 mm gescannt und sie in 9–11 kleine Bereiche unterteilt (Sub-FOV = 300 µm × 300 µm). Um repräsentative Werte zu erhalten, ist die gemeldete Anzahl für jede Gruppe der Durchschnitt aller 9–11 Unter-FOVs. Es wurden mehrere Bildanalysealgorithmen eingesetzt, darunter lokales Schwellenwertverfahren nach Bradley69, adaptive Kontrastverstärkung70 und größenabhängige Partikelidentifizierung. Abbildung 4d zeigt die erfasste QD-Zahl nach 2-stündiger Inkubation der Testprobe mit dem PC (im Bindungsgleichgewicht) als Funktion der seriell verdünnten miR-Konzentration, wobei 10 aM und 1 nM die niedrigste (ohne miR ausgenommen) und höchste Konzentration darstellen gemessen bzw. Die in Abb. 4d gezeigten Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, die aus drei biologischen Replikaten innerhalb eines einzelnen Flüssigkeitskompartiments erhalten wurde. Drei unabhängige Doppelblindexperimente wurden während der Zielkonzentrationsmarkierung, der Testinkubation und der Partikelzählung durchgeführt, um Rosinenpickerei zu vermeiden und andere anthropische Faktoren zu minimieren. Wie erwartet wurde mit 0 M miRNA-375 (Referenzgruppe in Abb. 4c) über die gesamte Bildgebungszeitdauer eine vernachlässigbare QD-Hintergrundbindung beobachtet. Mit einem signifikanten Zählunterschied zwischen der 3-fachen Standardabweichung bei 0 M wird eine Nachweisgrenze (LOD) von 10 aM nachgewiesen. Eine weitere Reduzierung der Zielkonzentration (1 aM und 100 zM) führt zu Zählergebnissen auf dem gleichen Niveau des Hintergrundsignals, da die Verfügbarkeit des an der Oberfläche erfassten Ziels nun durch das Probenvolumen begrenzt ist (siehe SI Teil 15). Ohne die PC-gestützte Einzelzielzählung erfordern die herkömmlichen analogen Intensitätsmessungen eine höhere Lasereinfallsleistung (5 mW) und die höchste EM-Verstärkungseinstellung (1200×) von der CCD-Kamera, um eine LOD von 1–10 pM zu erreichen (SI Abb . S16).

Um die Selektivität des Assays zu demonstrieren, haben wir mit NUPACK die Single-Base-Mismatch-Variation (Single-Nucleotide-Varianten, SNVs) für alle 22 Positionen entlang des miR-375-Ziels simuliert. Die Ergebnisse (SI, Abb. S17) zeigen, dass unser Brückenassay selektiv gegenüber der Einzelbasenvariation des Positionsindex 4-8 (gezählt vom 5′-Ende) ist, wo diese spezifische Mutation Berichten zufolge klinische Bedeutung hat71. Abbildung 4e, f veranschaulichen einen dramatischen Rückgang der Partikelzählung, der aus SNVs bei Index Nr. 4, Nr. 6 und Nr. 8 resultiert, mit einem Bereich von 90–92 % Signalreduzierung (Unterschied in den Zählergebnissen: \(\triangle N=\ frac{{N}_{{{\rm {PM}}}}-{N}_{{{\rm {MM}}}}}{{N}_{{{\rm {PM}}}} }\) = 90–92 %, mit zweiseitigen P-Werten von <0,0001) im Vergleich zur Perfect-Match-Gruppe (PM) nach 2 Stunden.

Zusätzlich zur Untersuchung des Endpunktwerts, wenn die Brückenbefestigungsreaktion das Gleichgewicht erreicht, verglichen wir auch die transiente Wechselwirkung zwischen dem QD und der PC-Oberfläche, indem wir die dynamischen Eigenschaften der Bewegungstrajektorien von QDs analysierten, die während des Prozesses die PC-Oberfläche abtasten der Bindung. Um die gesamte freie Energie des Systems zu erhöhen und die Interaktionsdauer zu verlängern, haben wir das Verhältnis von ssDNA-Sonde pro QD von 10:1 auf 5:1 reduziert. Wir beginnen mit der Aufnahme von Fluoreszenzbildsequenzen unmittelbar nach Zugabe der ssDNA-funktionalisierten QD-Sonden. Beginnend mit einer leeren Oberfläche beobachteten wir nach ca. 10 Minuten Inkubation mit der Testprobe eine QD-Emission in unserem Sichtfeld. Ein Einzelpartikel-Tracking-Algorithmus wurde mit der MATLAB u-track-Software72 implementiert und jede Partikelflugbahn wurde auf Diffusion analysiert. Wir beobachteten unterschiedliche Flugbahnen von oberflächenaktiven QDs und wählten zwei repräsentative Bilder aus, wie in SI Abb. S15 gezeigt, um ihren einzigartigen Fingerabdruck zu demonstrieren, der durch Bindungsunterscheidung verursacht wird. Wir gehen davon aus, dass die Manipulation der Dissoziationskonstante der miRNA-ssDNA-Wechselwirkung für den Brückenassay zu einer Variabilität des oberflächenlokalisierten Diffusionspfads führt. Nach der Standardmethode der Einzelnanopartikelverfolgung analysierten wir die Trajektorien weiter, indem wir die zeitabhängige mittlere quadratische Verschiebung (MSD) berechneten. Die resultierenden Trajektorien werden üblicherweise auf ihr Bewegungsverhalten hin analysiert, da die Bewegung Informationen über die Wechselwirkungen zwischen dem Partikel (QD-Sonde) und seiner Umgebung (verschiedene Zielsubstrate) liefert. Fünf lineare MSD-Diagramme (grün) in SI Abb. S15 zeigen normale Diffusion an, wenn das Zielsubstrat eine Einzelbasenfehlpaarung aufweist, und können durch r2 ∝ Dτ (r2: Diffusionsverschiebung, D: Diffusionskoeffizient und τ: Zeitintervall) beschrieben werden ). Umgekehrt nähert sich die MSD der Perfect-Match-Gruppe (blau) asymptotisch einem Maximalwert für größere τ an, was darauf hindeutet, dass die QD-Sonde einer begrenzten oder korralierten Diffusion mit einer Beziehung r2 ∝ 1−e−Dτ unterliegt.

Durch die Nutzung von PC-Verbesserungen sowohl bei der Nahfeld-QD-Anregung als auch bei der fernfelddispersionsgesteuerten Auskopplung haben wir eine einfache photonische Biosensorplattform entwickelt, die eine Verstärkung der QD-Emission um das bis zu 3000-fache ermöglicht. Wir konnten einzelne QDs sogar mit einer niedrigen numerischen Apertur von 0,5 auflösen und so einen kostengünstigen optischen Aufbau ermöglichen, der eine digitale Auflösung einzelner Zielmoleküle für eine hochspezifische, breite dynamische, schnelle und klinisch relevante attomolare miRNA-Detektion ermöglicht. Unsere PC-QD-Bildgebungsplattform erfordert keine hohe Verstärkung einer EMCCD-Kamera (×40, nur 1/30 der maximalen EM-Verstärkung der Kamera) und reduziert die Kosten und Komplexität des Instruments weiter.

Der Brückenassay wurde bei Raumtemperatur ohne enzymatisches Zielamplifikon durchgeführt, was im Vergleich zur qRT-PCR einen einfachen Arbeitsablauf darstellt. Die geringe Masse der QD-Tags dient dazu, schwerkraftbedingte Ausfällungen zu reduzieren, was zu niedrigen Hintergrundzahlen (durch unspezifische Bindung oder Adsorption) führt73. Durch die Vorinkubation des Target-Captures konnte sichergestellt werden, dass jedes an der Oberfläche befestigte QD nur ein einziges Zielmolekül enthält und somit eine lineare Dosis-Wirkungs-Kurve bereitgestellt wurde, die mit dem umfangreichen Bereich der Analytkonzentration (0,01 fM–1 nM) korreliert, und somit die Quantifizierung ohne diese erleichtert wurde die Notwendigkeit einer Korrektur nach der Erkennung durch Poisson-Statistikanalyse74. Wir beobachten ein lineares Dosis-Wirkungs-Diagramm, wenn unsere Daten auf einer Log-Log-Skala aufgetragen werden (Abb. 4b). Das beobachtete Verhalten ist das Ergebnis mehrerer Faktoren, darunter: (a) die begrenzte Diffusion75 der miRNA zur Biosensoroberfläche, wo sie eingefangen werden kann, insbesondere bei niedrigeren Konzentrationen, und (b) die sterische Hinderung und Oberflächensättigung, wo die Fraktion Die Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen auf der PC-Oberfläche wird bei hohen Konzentrationen verringert, was die Bindung neu ankommender miRNA erschwert76, 77. Wichtig ist, dass wir feststellen, dass das Dosis-Wirkungs-Diagramm (Abb. 4b) keine signifikante Überlappung zwischen benachbarten Konzentrationen zeigt auf den Standardabweichungswerten für drei unabhängige Messungen bei jeder Konzentration. Daher erfordert der in unserer Arbeit gezeigte Ansatz zur digitalen Auflösungsdetektion keine Poisson-Korrektur, wie dies für Ansätze wie ddPCR und Quanterix Simoa™ erforderlich ist, bei denen mehrere Zielmoleküle, die im selben Nanotröpfchenvolumen eingeschlossen sind, zusammen amplifiziert werden und dennoch nur ein positives Ereignis ergeben .

Einzelnukleotidvarianten (SNVs) können durch statische Zählung nach 2 Stunden mit hoher räumlicher Signalreduktion unterschieden werden. In einem weiteren Schritt untersuchten wir die kinetische und transiente Interaktion zwischen DNA-Hybridisierung mithilfe einer dynamischen Trajektorienanalyse einzelner QDs und demonstrierten die Fähigkeit, SNVs in 10 Minuten ohne Waschen zu unterscheiden, was einen weiteren Weg zur Unterscheidung bieten könnte, ob einzelne Tags spezifisch gebunden sind oder unspezifisch. Interessanterweise können wir mit den kombinierten Verstärkungseffekten QD-Sättigung und Multiexzitonenerzeugung beobachten, wenn die Eingangslaserleistung unter PC-Resonanzbedingungen bei Raumtemperatur mehr als 3 mW beträgt (ergänzende Abbildung S7).

Unsere PC-gestützte QD-Emissionsplattform ist nicht strikt auf eine einzelne Wellenlänge beschränkt. Indem man die spektralen Überlappungs- und Dispersionseigenschaften der verschiedenen von den PCs unterstützten Leaky-Modi optimiert, kann man den Verstärkungseffekt auf ein breites Spektrum fluoreszierender Spezies ausweiten, die dieselbe Anregungswellenlänge verwenden (z. B. QD-525, QD-565, QD). -585, QD-625, QD655, QD685). Obwohl dies nicht der Schwerpunkt dieses Berichts ist, gehen wir davon aus, dass der hier beschriebene Ansatz durch die zukünftige Verwendung von QD-Tags mit unterschiedlichen Emissionsspektren leicht gemultiplext werden kann, wobei jede QD-Farbe einen Test für eine andere miRNA-Zielsequenz in derselben Testprobe darstellen kann . In zukünftigen Arbeiten werden wir mehrere Ziel-miRNA-Sequenzen mit unterschiedlichen co-immobilisierten Capture-DNA-Sequenzen kombinieren, um Multiplexing innerhalb einer einzelnen Testregion zu ermöglichen.

Die PC-Herstellung begann mit der anschließenden Abscheidung einer 10 nm dicken Al2O3-Ätzstoppschicht und eines 130 nm dicken SiO2-Dünnfilms auf einem Glassubstrat mit 200 mm Durchmesser (Corning, 0,7 mm Eagle XG-Displayglas). Die Subwellenlängen-Gitterstrukturen wurden dann durch großflächige Lithographie im tiefen Ultraviolett (DUV) strukturiert, gefolgt von Trockenätzen, das von einer Gießerei (Moxtek, Inc. Orem, UT) durchgeführt wurde. Der Wafer wurde dann in kleine Chips (1,2 cm × 2,5 cm) geschnitten. Ein Si3N4-Film mit hohem Brechungsindex (~115 nm) und eine dünne biokompatible TiO2-Beschichtung (~5 nm) wurden mittels Sputtern (Kurt J. Lesker PVD 75) auf dem strukturierten Substrat abgeschieden (Details zur Charakterisierung siehe Ergänzung).

Wir verwendeten ein selbstgebautes Linienfokussierungsmikroskop (ergänzende Abbildung 3), um das PC-QD-System anzuregen und die Fluoreszenzintensität, das Emissionsspektrum und die Scanergebnisse von miRNA-Assays der QDs zu untersuchen. Als Anregungslichtquelle dient eine 450 nm Laserdiode (OSRAM, PL450B). Die Fluoreszenzsignale werden von einem bildgebenden Spektrometer (Horiba iHR 550) mit einer elektronenvervielfachenden ladungsgekoppelten Kamera (EM-CCD) (Hamamatsu, C9100-13) abgebildet. Alle Assay-Scanbilder auf dem PC und Tests zum Anregungsverstärkungsfaktor werden mit einer Linse mit niedriger NA × 50 und geringer Laserleistung (Olympus LMPLFLN × 50, NA = 0,5; Laserleistung = 1 mW) durchgeführt. Da einzelne QDs mit einer Linse mit niedriger NA nicht auf Glas aufgelöst werden können, werden die Extraktionsverstärkungsfaktortests und Blinkvergleichsexperimente mit einer Linse mit hoher NA × 100 und höherer Laserleistung (Zeiss Alpha Plan-APO × 100 Oicl DIC, NA =) durchgeführt 1,46; Laserleistung = 2,1 mW). Experimentelle Bilder der hinteren Brennebene wurden mit einem Bertrand-Objektiv (Brennweite 180 mm) und x100-Objektiven von Olympus (LMPLFLN x100, NA = 0,8) aufgenommen.

Eine winkelaufgelöste Fernfeldcharakterisierung von bloßem PC wurde durchgeführt, um Qualitätsfaktoren für die Berechnung der geschätzten Verbesserungseffekte zu demonstrieren. Die Probe wurde mit Wasser bedeckt und auf einem motorisierten Rotor montiert, dessen y-Achse auf die Rotationsachse ausgerichtet war. Ein kollimierter Strahl (Fläche ~ 5 mm2) weißen Lichts von einer Deuterium-Halogen-Lampe durchläuft einen linearen Polarisator (TE-Polarisation) und trifft im Einfallswinkel θ auf die Probe. Das reflektierte Licht nullter Ordnung in einer Reihe von Einfallswinkeln wurde mithilfe optischer Fasern gesammelt und an das Spektrometer gesendet (Ocean Optics 20000). Das ausgekoppelte Emissionsspektrum des PC-QD-Systems wurde in einem Winkel θcol = 26° gesammelt und durch eine Linse auf den Spalt des Spektrometers (Acton Research, SpectraPro 500i) mit einer CCD-Kamera (Princeton Instruments, PIXIS) fokussiert.

Die zeitaufgelöste Photolumineszenz (TRPL) wurde an Ensemble-QDs mit einem speziell angefertigten Aufbau gemessen (ergänzende Abbildung S4). Die Anregungsquelle war ein Ti:Saphir-Laser (Spectra-Physics Mai Tai) mit einem optisch parametrischen Oszillator, der 100–120 fs-Impulse bei λlaser = 425 nm und einer Wiederholungsrate von 80 MHz erzeugte. Die Anregung erfolgte außerhalb der Resonanz des PC-Pumpmodus (θin = 26°) mit einer Leistung von 2,1 mW. Die Emission wurde in einem QD-Auskopplungswinkel (θcol = 26°) gesammelt und durch 550-nm-Langpassfilter geleitet, um den Anregungslaser zu entfernen, und auf Silizium-Einzelphotonen-Lawinenfotodioden (Si-SP-APDs) abgebildet. Die APDs waren mit einem zeitkorrelierten Einzelphotonen-Zählmodul verbunden, das einen Einzelphotonen-Parameter-Tag-Modus und Photonenverteilungsmodi zusammenstellte, um das Histogramm der Photonenankunftszeiten zu erstellen. Die zeitliche Auflösung des Systems betrug ~22 ps.

Alle Messungen wurden bei einer durchschnittlichen auf den PC einfallenden Leistung von 1–2,1 mW durchgeführt. Basierend auf der Abhängigkeit der emittierten Intensität als Funktion der Anregungsleistung schließen wir, dass die Messungen aller Proben im linearen (ungesättigten) Bereich durchgeführt wurden (ergänzende Abbildung S7).

Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bilder der QDs wurden mit dem JEOL 2100 Cryo TEM bei 200 kV aufgenommen. Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der PC-QD-Probe wurden mit einem Hitachi S-4800 Feldemissions-REM aufgenommen. Vor dem SEM wurde eine dünne leitfähige Schicht (~6 nm, Gold-Palladium für die Vogelperspektive und Kohlenstoff für die Querschnittsansicht) auf die Probe aufgesputtert.

Die Querschnittshöhenprofile des PCs wurden mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) (Cypher, Asylum Research) im Kontaktmodus unter Verwendung einer monolithischen Siliziumspitze mit einer 30 nm dicken Aluminiumreflexbeschichtung (Budget Sensors) analysiert.

PC-Chips wurden 2 Minuten lang in Aceton (Sigma-Aldrich), Isopropylalkohol (Sigma-Aldrich) und entionisiertem Wasser beschallt und unter einem Strom komprimierten Stickstoffs getrocknet, gefolgt von einer 200-W-Sauerstoffplasmabehandlung bei einem Druck von 500 mTorr für 10 Minuten mit einem Pico Plasma System (Diener electronic, Deutschland). In einer Glasreaktionskammer wurde (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilan (GLYMO, Gelest, Morrisville, PA, USA) in einem Vakuumofen bei einer Temperatur von 80 °C und 30 Torr 4–5 Stunden lang auf die PC-Oberfläche aufgedampft . Für jeden PC-Chip in der Gasphasenabscheidung wurden 100 μl GLYMO in die Reaktionskammer aus Glas gegeben. Die abgeschiedenen PC-Chips wurden aus dem Ofen genommen und 2 Minuten lang in Toluol (Sigma-Aldrich), Methanol (Sigma-Aldrich) bzw. entionisiertem Wasser beschallt und mit Stickstoff getrocknet. Für die DNA-Funktionalisierung einer 1,25 cm2 großen PC-Oberfläche wird ein Volumen von 40 μl, 50 μM Amino-terminiertes PC-Capture-Oligo (1×TE-Puffer, 0,05 % TWEEN-20, pH = 9,0) und auf dem mit GLYMO hinterlegten PC verteilt Oberfläche. Nach 6-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die PC-Chips durch eine allmähliche Verringerung der TE-Pufferkonzentration von 1x auf 0,01x gespült. Ein Blockierungspuffer (SuperBlock TBS, Thermo Fisher Scientific) wurde 20 Minuten lang zugegeben und vor der Verwendung zweimal mit 1 × TE-Puffer gewaschen.

Mit Streptavidin (SA) beschichtetes QD605 (Invitrogen) wurde nach 3-minütiger Zentrifugation bei 5000 × g vom Überstand abgetrennt. ssDNA-Sonden und mit Streptavidin (SA) beschichtetes QD605 (Invitrogen) werden im stöchiometrischen Verhältnis von 10:1 (Sonde:QDs) in 1×TE-Puffer konjugiert und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, während in einem Rotator vorsichtig gemischt wird, um eine ausreichende Menge sicherzustellen Reaktion. Das Konjugat wurde dann mit einem 0,5-ml-Amicon-Filter (MWCO 50 kDa) filtriert, um die freien DNA-Sonden aus der Lösung zu entfernen. Die Endkonzentration der QDs beträgt ~68 nM.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen erhältlich oder auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (NIH) R01-GM108584 (BTC), R01-CA227699 (AMS, BTC und MK), R01-CA212097 (MK) und der National Science Foundation (NSF) CBET-1900277 (BTC) unterstützt ), das Postdoktorandenstipendium des Carl Woese Institute for Genomic Biology (TC und LZ) und das Cancer Center in Illinois für das C*STAR-Forschungsstipendium (YX) und das TiME-Stipendium (OHA). Die Autoren danken GA Fried, G. Popescu, JANT Soares, PR Selvin, S. Sarkar, OR Teniola, DE Vaz, LE Kwon, J. Tibbs, S. Shepherd, BK Maity, AJ Cyphersmith, E. Araud, C. -W. Kuo, Y. Zhuo, P. Le, F.-C. Hsiao, LD Akin, S. Nalla, N. Chauhan, A. Igarashi und der Rest der Nanosensor-Gruppe für wertvolle Diskussionen. Die Autoren danken H. Zhou, JC Spear, KA Walsh, W. Swiech und KM Flatt vom Materials Research Lab der University of Illinois in Urbana-Champaign für ihre Schulung und Unterstützung sowie W. Wang für die Unterstützung bei der Deckglasreinigung. Die Autoren danken außerdem MOXTEK, Inc. und Y. Yan für die Bereitstellung der REM-Bilder der Gitterstruktur.

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Yanyu Xiong, Qinglan Huang, Priyash Barya, Shengyan Liu, Caitlin M. Race und Brian T. Cunningham

Holonyak Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Yanyu Xiong, Qinglan Huang, Taylor D. Canady, Priyash Barya, Shengyan Liu, Caitlin M. Race, Congnyu Che, Xiaojing Wang, Lifeng Zhou, Xing Wang, Andrew M. Smith und Brian T. Cunningham

Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Taylor D. Canady, Xiaojing Wang, Lifeng Zhou, Xing Wang und Brian T. Cunningham

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Opeyemi H. Arogundade, Congnyu Che, Xing Wang, Andrew M. Smith und Brian T. Cunningham

Abteilung für Onkologie, Huntsman Cancer Institute, Salt Lake City, UT, 84112, USA

Manish Kohli

Carle Illinois College of Medicine, Urbana, IL, 61801, USA

Andrew M. Smith

Abteilung für Materialwissenschaft und Werkstofftechnik, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Andrew M. Smith

Krebszentrum in Illinois, Urbana, IL, 61801, USA

Andrew M. Smith und Brian T. Cunningham

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YX und BTC haben alle Experimente konzipiert und gestaltet. YX führte alle optischen Experimente und Bioassay-Experimente durch und baute den optischen PCEF-Aufbau mit Unterstützung von QH, CMR, CMR hat die PC-Struktur und die Zeilenscan-Software entworfen. YX und TDC haben den Brückenassay entwickelt. YX, PB, SL und QH führten die Simulationen durch. SL, YX und PB berechneten den Verstärkungsfaktor. OHA führte die Gelelektrophorese durch. CC führte die Diffusionssimulation durch. YX führte SEM-, TEM-, AFM- und optische Charakterisierungen durch. LZ und Xing W. stellten experimentelle Materialien für Bioassays in menschlichem Serum zur Verfügung. BTC, AMS, MK und Xing W. betreuten die Studie. MK identifizierte den miRNA-Zielbiomarker. YX hat das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Brian T. Cunningham.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xiong, Y., Huang, Q., Canady, TD et al. Photonischer Kristall verstärkte Fluoreszenzemission und Blinkunterdrückung für die Biosensorik mit Einzelquantenpunktauflösung und digitaler Auflösung. Nat Commun 13, 4647 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

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Eingegangen: 21. Juni 2021

Angenommen: 29. Juli 2022

Veröffentlicht: 08. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

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